黃興琳，陸俊杏，廖冰楠，白輝揚，管麗，張濤

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

油用牡丹脂肪酸脫氫酶基因FAD3的克隆與表達分析

黃興琳，陸俊杏，廖冰楠，白輝揚，管麗，張濤

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

【目的】ω-3脂肪酸脫氫酶(ω-3 FAD)為植物脂肪酸生物合成途徑中的關鍵酶，通過對油用牡丹‘鳳丹’ω-3 FAD基因結構特征及其在不同組織中的表達模式進行分析，為研究FAD3在油用牡丹‘鳳丹’脂肪酸形成過程中的調(diào)控提供理論基礎。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘鳳丹’ω-3 FAD基因，用Vector NTI Advance 11軟件進行序列分析，BLAST進行同源性比較，并用MEGA7.0的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，利用在線蛋白質(zhì)分析工具ExPASy預測FAD3蛋白的基本參數(shù)和特性，利用Phyre2預測蛋白質(zhì)二級和三級結構，并通過實時熒光定量PCR檢測該基因在油用牡丹‘鳳丹’不同發(fā)育期的種子以及不同組織中的特異性表達情況?！窘Y果】獲得油用牡丹‘鳳丹’脂肪酸脫氫酶FAD3，命名為FAD3（GenBank登錄號：KX906966）。序列分析表明該基因cDNA序列全長1 723 bp，其中，開放閱讀框1 308 bp，編碼435個氨基酸，3′端非編碼區(qū)長287 bp，5′末端非編碼區(qū)長99 bp，預測成熟蛋白分子量為49.9 kD，理論等電點（pI）為7.42，N端無信號肽，脂肪系數(shù)為83.08，不穩(wěn)定指數(shù)35.67，總水平親水性為-0.222。經(jīng)FAD3蛋白的二級結構預測，F(xiàn)AD3以α-螺旋、隨機卷曲為主，其次是延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角含量較少；多序列比對結果表明，油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2個保守結構域，系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示‘鳳丹’與芍藥處于同一分支，其親緣關系最近。TMHMM和TargetP亞細胞定位分析得知，F(xiàn)AD3蛋白有3個跨膜區(qū)域，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮功能。組織特異性結果分析表明，F(xiàn)AD3在‘鳳丹’的根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊、種子中均有表達，其中，在葉中表達量最高，雌蕊次之，在雄蕊中表達量最低；不同時期種子中，10 d表達量最高，20 d次之，在60 d中表達量最低?！窘Y論】成功從油用牡丹‘鳳丹’中克隆獲得FAD3全長cDNA序列，其在‘鳳丹’不同組織中呈現(xiàn)出多種表達模式。

油用牡丹；脂肪酸脫氫酶；克?。粚崟r熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】α-亞麻酸（ALA，C18:3）屬ω-3系列不飽和脂肪酸，為人類必需脂肪酸，是DHA和EPA的合成前體，具有促進大腦發(fā)育、預防神經(jīng)和心腦血管疾病、降低血脂和抑制衰老等重要作用，對人體正常發(fā)育和生長代謝起著至關重要的作用[1-3]。但人體由于缺乏ω-3脂肪酸脫氫酶，不能使亞油酸轉(zhuǎn)化為ALA，所以必須依靠食物來獲取[4-6]。目前，ALA的來源主要是深海魚油，但中國深海魚油資源較為貧乏，而日常食用菜籽油、豆油、葵花油等植物油雖然含有較為豐富的亞油酸，但ALA的含量卻很低（5%左右）。在正常飲食情況下，人體往往不能足量攝入所需的ALA，致使中國人群膳食中普遍缺乏ALA，因此，挖掘和開發(fā)富含ALA的植物資源具有重要的應用價值[7-8]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）屬芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹種（Sect.Moutan DC.），是一種聞名世界的多年生開花植物，在中國已有超過3 000年的栽培歷史。油用牡丹是產(chǎn)籽量和出油率較高（≥22%）的牡丹統(tǒng)稱，近年來，人們發(fā)現(xiàn)牡丹籽油不飽和脂肪酸含量達92%左右，特別是ALA含量高達40%以上，它除了具有獨特的觀賞和藥用價值外，還是一種經(jīng)濟效益較高的新興木本油料作物[9-11]?！习摺≒aeonia rockii）和‘鳳丹’（Paeonia ostii）牡丹是目前作為油料作物栽培的主要油用牡丹品種，它們不僅耐寒抗旱、適應力強，而且株型高大、結實率好，主要分布于安徽銅陵、山東菏澤、四川、甘肅、陜西秦嶺、河南洛陽等地[12-14]。分離克隆控制ALA合成積累的關鍵酶基因，深入研究油用牡丹種子高效合成積累ALA的分子機理，可為油用牡丹種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】在植物脂肪酸合成代謝過程中，油脂合成關鍵酶基因的表達水平對合成脂肪酸的類型及數(shù)量起重要的作用。植物ALA由ω-3脂肪酸脫氫酶（FAD3、FAD7、FAD8）催化亞油酸而來，該酶是不飽和脂肪酸合成途徑的一個限速酶，通過調(diào)節(jié)該酶的過量表達，可以使植物中ALA的含量增加。植物中一般存在 2種 ω-3 FAD，一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（FAD3），另一種在質(zhì)體中（FAD7、FAD8），植物種子中的ALA主要是通過ω-3 FAD3催化合成[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥種子中過表達ω-3 FAD3基因，可使ALA含量從19%增加到39.6%[16]。在大豆種子中的異位表達擬南芥ω-3 FAD3基因可使ALA含量獲得提高[17-18]。將芝麻 FAD7質(zhì)體定位信號序列替換為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號，將其導入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草種子中ALA含量達4.78%—6.77%[19]。將紫蘇ω-3 FAD3基因?qū)脶劸平湍窱NVSc1中，發(fā)現(xiàn)工程菌可以將底物亞油酸轉(zhuǎn)化為 ALA，其含量占總脂肪酸的 4%左右[20]。MURAKAMI等[21]使煙草中ω-3 FAD基因沉默，導致突變株的ALA含量比野生型植株明顯減少，并能更好地適應高溫環(huán)境。ZHOU等[22]發(fā)現(xiàn)ω-3 FAD基因的過量表達可顯著提高白楊的抗冷性。以上研究結果表明，ω-3 FAD基因不但能夠提高植物ALA的含量，而且還可改良植物對溫度等逆境脅迫的適應性。近年來，人們陸續(xù)克隆了一些植物的微粒體或質(zhì)體ω-3 FAD基因，并應用于基因工程研究，該方向已成為植物脂肪酸代謝積累調(diào)控和遺傳改良研究的一個熱點領域?！颈狙芯壳腥朦c】油用牡丹作為目前發(fā)現(xiàn)的ALA含量最高的木本油料植物資源之一，是具有較好應用前景的油脂工程研究對象，但目前國內(nèi)外有關油用牡丹的研究主要側(cè)重于其栽培技術、成分分析、藥理及相關產(chǎn)品開發(fā)等方面，而對油用牡丹的分子生物學研究相對較少，尤其是對ALA高效合成關鍵基因的生物學功能等決定其優(yōu)異品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)缺乏相應的研究，目前國內(nèi)外對于油用牡丹脂肪酸脫氫酶基因的分子作用機制等鮮有報道[10]。【擬解決的關鍵問題】本研究在對油用牡丹‘鳳丹’FAD3基因進行克隆與生物信息學分析基礎上，采用實時熒光定量PCR技術對不同組織中FAD3進行表達分析，為進一步開展FAD3在不飽和脂肪酸生物合成過程中的調(diào)控作用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

油用牡丹品種‘鳳丹’（Paeonia ostii）種植于重慶師范大學牡丹試驗基地。試驗于2016年3月至2016 年6月在重慶師范大學油用牡丹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室完成。分別在開花時取材根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊；授粉后以每10 d為間隔，分別取材10、20、40、60和80 d的牡丹種子，經(jīng)液氮速凍后-80℃保存，備用。

工程菌Escherichia coli DH5α為細胞與遺傳學實驗室保存。Premix Taq酶、T4DNA連接酶、DL2000 Marker、T/A克隆載體pGEM-T、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司。EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（DNaseⅠ）購于北京博邁德公司。熒光定量試劑盒購于成都百樂公司。

1.2 引物設計和基因克隆

從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中查詢獲得2條芍藥EST序列信息，GenBank登錄號分別為GBFN01008505.1和 KM575841.1。據(jù)此采用軟件Primer Premier 5.0分別設計5′端和3′端RACE引物，上游引物PsFAD-GSP1.1：5′-GCTGCTGCCAATCCAAACACCACA-3′和PsFADGSP2.1：5′-CTCCATTAAAGCCACCACCGCCATC-3′；下游引物PsFAD-NGSP1.1：5′-CCTCACCAACCCCAT TAGTGGCATCT-3′和PsFAD-NGSP2.1：5′-GGGTTG GTGAGGAAGACGATTTTGAC-3′。按照試劑盒使用說明提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用設計的引物，以上述cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物純化，回收，連接克隆載體pGEM-T，然后轉(zhuǎn)化DH5α，進行抗性篩選，PCR鑒定后挑選單克隆送測序。引物及測序均由英濰捷基有限公司完成。

1.3 FAD3組織特異性表達分析

根據(jù)已克隆的油用牡丹‘鳳丹’FAD3的cDNA序列分析結果，設計熒光定量 PCR引物，分別以根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊、不同時期種子的cDNA為模板，以 PUF1639（Protein of unknown function 1639 gene）為內(nèi)參基因[23]，反應所用引物為PUF1639Forward：5′-AAACGAGTCGGTTGAAGA TGAG-3′，PUF1639Reverse：5′-TATGCGGTGGATTT CGGAG-3′。FAD3Forward：5′-TTGCTGAGATCCGAG CTGCCATTC-3′，F(xiàn)AD3Reverse：5′-GCAGCCCAATA GAATGGCCAAACAAC-3′。實時熒光定量PCR檢測FAD3在不同器官中的表達水平。RT-PCR依照SYBR? Premix Ex TaqTM II（TaKaRa公司）使用說明在儀器CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司）上進行。每處理3個生物學重復，3個技術重復，結果用于平均數(shù)統(tǒng)計和方差分析。

1.4 FAD3生物信息學分析

用Vector NTI Advance 11軟件進行序列比對、查找開放閱讀框和翻譯，ExPASy在線服務器分析FAD3蛋白的分子量、等電點pI、疏水性等。SignalP4.1 server分析信號肽，TMHMM Server v.2.0分析跨膜區(qū)等。利用 Phyre2在線分析蛋白質(zhì)結構和結構域，并構建FAD3蛋白的三維結構。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法對同源蛋白構建進化樹。

2 結果

2.1 FAD3全長cDNA的克隆

分別通過RACE法，以油用牡丹葉片cDNA為模板進行PCR擴增、T/A克隆和測序分析，獲得5′末端序列長度約700 bp（圖1-A），獲得3′末端序列長度約1 300 bp（圖1-B）。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果與預測大小一致。測序獲得兩末端片段后通過NCBI上BLAST比對分析確定起始密碼子AT的位置，即FAD3的5′端，3′端存在明顯的poly（A）加尾現(xiàn)象。Vector NTI Advance 11軟件分析后進行電子拼接，成功從油用牡丹中克隆到全長FAD3（GenBank登錄號為 KX906966），發(fā)現(xiàn)該基因全長序列共1 723 bp，其中5′非翻譯區(qū)99 bp，3′端非翻譯區(qū)共287 bp，包含1 308 bp的完整開放閱讀框。經(jīng)BLASTn序列比對表明，克隆的FAD3與芍藥（Paeonia lactiflora）FAD3 （KM575841.1）具有97%的相似性，遠高于其他物種的基因。

圖1 FAD3的RACE PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1 The product of PCR amplification of FAD3 gene by RACE

2.2 FAD3蛋白質(zhì)的等電點、分子量及二級結構、三級結構的預測

FAD3編碼435個氨基酸，預測分子量為49.9 kD，等電點為 7.42，帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）有 40個，帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）有 40個，該蛋白脂肪系數(shù)為83.08%，不穩(wěn)定指數(shù)為35.67。分析FAD3蛋白的親疏水性發(fā)現(xiàn)，總水平親水性系數(shù)（GRAVY，grand average of hydropathicity）為-0.222，屬親水性蛋白。利用Phyre2軟件對蛋白二級、三級結構預測結果表明，F(xiàn)AD3蛋白主要為α-螺旋（28.51%）、隨機卷曲（37.93%）、延伸鏈（21.38%）和 β-轉(zhuǎn)角（12.18%），推測該蛋白的結構功能域可能主要由α-螺旋構成（圖2）。

2.3 FAD3蛋白質(zhì)的跨膜域、信號肽、磷酸化位點、結構域預測

SignaIP server預測該蛋白無信號肽，TMHMM Server v.2.0分析具有3個跨膜域。亞細胞定位軟件WoLF PSORT預測FAD3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮功能。NetPhos2.0預測它具有18個潛在的磷酸化位點，主要包括10個絲氨酸（Serine）、4個蘇氨酸（Threonine）和4個酪氨酸（Tyrosine）。由此推測FAD3蛋白活性可能與其磷酸化調(diào)控有一定聯(lián)系。利用 NCBI在線分析工具CDD分析保守結構域（CD），結果表明，F(xiàn)AD3屬于 Membrane-FADS-like蛋白超家族（圖3）。

2.4 FAD3蛋白質(zhì)與其他植物蛋白的進化分析

圖2 Phyre2預測的FAD3三級結構Fig. 2 FAD3 tertiary structure predicted by Phyre2

從NCBI中查找到10種植物的FAD3蛋白序列，采用MEGA7.0鄰接法與油用牡丹FAD3蛋白序列對比并建立無根系統(tǒng)進化樹，結果表明，油用牡丹‘鳳丹’與芍藥（Paeonia lactiflora，AJA36814.1）、麻風樹（Jatropha curcas，NP_001295746.1）、煙草（Nicotiana tabacum，NP_001313206.1）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii，NP_001296282.1）、大豆（Glycine max，NP_001239777.1） 、 葡 萄 （ Vitis vinifera，XP_002277573.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAL32546.1）、甘藍（Brassica oleracea var. Oleracea，XP_013620518.1）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010031203.1）、芝麻（Sesamum indicum，NP_001306619.1）等10個高等植物的FAD3蛋白序列比對顯示，11個植物FAD3氨基酸序列被聚為兩大類，‘鳳丹’與芍藥處于同一分支，其親緣關系最近，其序列一致性為98.0%，其次與麻風樹、煙草、雷蒙德氏棉蛋白親緣關系較近，一致性分別為70.0%、73.0%和75.0%；與大豆、葡萄、擬南芥、甘藍、巨桉、芝麻等物種的FAD3蛋白的親緣關系較遠（圖4），推測‘鳳丹’FAD3的功能可能與芍藥屬FAD3功能相似。

2.5 FAD3實時熒光定量分析

實時熒光定量分析表明（圖 5），從其組織特異性表達來看，‘鳳丹’FAD3在不同器官中均有表達，在葉中的表達量最高，與其他組織的差異達到極顯著，是雌蕊中表達的3—4倍，且是根、莖的17—25倍，約是雄蕊的250倍。在不同發(fā)育時期的種子中，表達量隨著種子成熟逐漸呈下調(diào)趨勢，其中10 d的表達最高，約為60 d的25倍；20 d次之，40 d以后表達量明顯降低（圖6）。

圖3 FAD3保守結構域的預測結果Fig.3 Prediction of FAD3 conserved domain

圖4 ‘鳳丹’FAD3與其他植物FAD3蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of FAD3 proteins from Paeonia ostii and other plants

圖5 FAD3在不同組織中的相對表達量Fig. 5 The relative expression of FAD3 gene in different tissues

圖6 FAD3在不同時期種子中的相對表達量Fig. 6 The relative expression of FAD3 gene in seeds of different growth stages

3 討論

本研究以油用牡丹‘鳳丹’為研究對象，在已知芍藥FAD3部分片段的基礎上進行RACE擴增，克隆獲得‘鳳丹’FAD3的全長cDNA序列，通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，所得目的片段與同屬植物芍藥相似性極高?！P丹’FAD3編碼的蛋白質(zhì)具有植物ω-3脂肪酸脫氫酶的一般特征：在蛋白的二級結構中，主要以 α-螺旋和隨機卷曲為主，推測其三維空間結構可能由 α-螺旋形成中心軸盤繞成螺旋狀的結構，這表明跨膜蛋白FAD3的α-螺旋能夠與生物膜表面發(fā)生相互作用，這種互作可能在蛋白跨膜過程中發(fā)揮重要作用[24-26]。序列比較分析表明，牡丹‘鳳丹’FAD3同芍藥、麻風樹、煙草、雷蒙德氏棉等10種高等植物的FAD3氨基酸序列同源性高達70%以上，11種植物都具有 FAD3的 1個保守結構域，同屬Membrane-FADS-like蛋白超家族，表明該結構域在進化過程中的穩(wěn)定性較高，這可能與其在生長代謝中所具有的功能相關[27]。油用牡丹‘鳳丹’FAD3氨基酸序列進化分析表明，‘鳳丹’FAD3與芍藥聚為一類，這說明同科同屬相似性高的基因可能在脂肪酸合成中發(fā)揮相似的功能[28]。通過 TMHMM Server v.2.0跨膜結構預測和WoLF PSORT亞細胞定位分析得知，牡丹‘鳳丹’FAD3蛋白具有3個跨膜結構域，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮功能，SignaIP server預測該蛋白無信號肽。

研究發(fā)現(xiàn)，紅花ω-3脂肪酸脫氫酶基因CtFAD3在根、莖、葉、花、葉柄及種子中均能表達，且在花中的表達量最高,其次是葉片[29]。紫蘇 FAD3在紫蘇根、莖、葉、花、種子中均有表達,但表達量存在明顯差異,其中在種子中的表達量最高，遠高于其他組織器官，分別是花、葉、莖和根中表達量的8倍、9倍、43倍和58倍[30]。而本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD3在‘鳳丹’的7個組織器官中均能檢測到表達（圖5和圖6），但其特異性差異較顯著，其中FAD3在牡丹的葉片中表達量最高，雄蕊中表達最低，前者約為雄蕊的250倍；葉片的相對表達約為10 d幼種的14倍；在不同發(fā)育時期的種子中都有表達，結實期10 d幼種的表達積累達到峰值，是成熟期種子（60和80 d）的25倍左右；20 d種子的表達是成熟期種子（60和80 d）的15倍左右。該結果與紫蘇中有所不同，可能在牡丹種子不飽和脂肪酸形成過程中還存在其他基因的共同作用。結合LI等[10]研究來看，表明授粉后種子中不飽和脂肪酸脫氫酶迅速積累，此時正為亞油酸脫氫形成亞麻酸做準備；隨著種子逐漸成熟，F(xiàn)AD3表達量呈下調(diào)趨勢，而亞麻酸含量隨之增加，在此過程中該基因的去飽和作用在峰值后慢慢變小，可能FAD3的活性與底物亞油酸含量的變化相關，說明本研究克隆得到的FAD3可能在牡丹不飽和脂肪酸合成途徑中發(fā)揮重要作用[31]。

通過對FAD3在油用牡丹‘鳳丹’中的組織特異性表達分析，表明FAD3在油用牡丹‘鳳丹’不飽和脂肪酸的積累過程中發(fā)揮重要作用，為研究脂肪酸生物合成的分子機理及利用基因工程手段來調(diào)控α-亞麻酸含量提供了理論依據(jù)。

4 結論

成功從油用牡丹‘鳳丹’中克隆獲得FAD3全長cDNA序列，其在不同組織中呈現(xiàn)出多種表達模式。

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（責任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Fatty Acid Desaturase Gene FAD3 from Oil Peony

HUANG XingLin, LU JunXing, LIAO BingNan, BAI HuiYang, GUAN Li, ZHANG Tao
(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331)

【Objective】 The Omega -3 fatty acid desaturase (ω-3 FAD) is a key enzyme in the fatty acid biosynthesis pathway of plant. Through analysis of omega-3 fatty acid desaturase gene structure and its expression in different tissues from Paeonia ostii, this study will lay a foundation for the research of regulating effects of FAD3 gene on fatty acid biosynthesis and provide a theoretical basis for the formation in the process of regulation. 【Method】 The FAD gene from Paeonia ostii (FAD3) was cloned using RT-PCR and RACE-PCR strategies. Nucleotide sequence was analyzed using Vector NTI Advance 11 software. Homology was analyzed using BLAST. A phylogenetic tree was constructed using neighbor-joining of MEGA 7.0. The secondary structure and three-dimensional model of FAD3 were predicted using ExPASy and Phyre2, respectively. Expression profiles of FAD3 at different developmental stages and in different tissues of the P. ostii were assayed using real-time quantitative PCR. 【Result】 The FAD genein P. ostii was cloned and named as FAD3 (GenBank accession number: KX906966). The full length of FAD3 cDNA is 1 723 bp, contains a 1 308 bp open reading frame (ORF) encoding a putative protein of 435 amino acids with a molecular mass of 49.9 kD and an isoelectric point (pI) of 7.42. The 3′-untranslated region of 287 bp and 5′-untranslated region of 99 bp were obtained from the FAD3 gene of P. ostii. N end without signal peptide, fat coefficient is 83.08, instability index 35.67, the grand average of hydrophobicity value of -0.222. By FAD3 protein secondary structure prediction, FAD3 mainly in the alpha helix and random coil, followed by less extended strand, beta turn content; multiple sequence alignment results showed that it contains two conserved domains of FAD3 gene. Phylogenetic tree analysis showed that the P. ostii has the closest evolutionary relationship with P. lactiflora. Subcellular localization analysis of TMHMM and Target P indicated that it might be targeted to the endoplasmic reticulum with three transmembrane regions. FAD3 gene was expressed in the root, stem, leaf, petal, pistil, stamen and seed of P. ostii by the tissue-specificity expression. The expressive content of FAD3 gene in different tissues of P. ostii was different: The highest was leaf, the next was pistil, and the lowest level was in stamen; In different periods of seeds, the highest expression was seeds of 10d, the next was 20d, in 60d expression was the lowest. 【Conclusion】 The full length cDNA sequence of FAD3 gene was successfully cloned from P. ostii, It shows a variety of expression patterns in different tissues, which laid a foundation for the further study on the function and expression regulation mechanism of FAD3 gene in the process of unsaturated fatty acid biosynthesis.

Paeonia suffruticosa Andr.; fatty acid desaturase; cloning; real-time PCR

2016-10-27；接受日期：2017-01-24

國家自然科學基金（31171588）、重慶市林業(yè)重點科技攻關項目（渝林科研2015-3）、重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項（cstc2016shmszx80051）、重慶師范大學基金（14XLB015）

聯(lián)系方式：黃興琳，Tel：18716439877；E-mail：huangxlcf@163.com。通信作者張濤，Tel：15902359879；E-mail：zht2188@126.com