金梅，康琳，孫東禹，樸君，樸敬愛，趙鳳琴

（遼寧師范大學生命科學學院/遼寧省生物技術與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧大連 116081）

慢病毒介導小鼠 K26/KAP26.1 基因過表達對相關基因的調控作用

金梅，康琳，孫東禹，樸君，樸敬愛，趙鳳琴

（遼寧師范大學生命科學學院/遼寧省生物技術與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧大連 116081）

【目的】利用慢病毒介導過表達技術，明確小鼠 K26 和 KAP26.1 基因過表達后對角蛋白關聯蛋白基因 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 和對骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因 BMP-4、BMPR-IB 的影響，探究小鼠絨毛細度變化的影響機制，達到人為調控（如慢病毒載體技術）使相關基因過表達，改善動物絨毛品質的目的，為哺乳動物絨毛細度調控的研究奠定理論基礎，【方法】試驗在遼寧省生物技術與分子藥物研發(fā)重點實驗室完成，小白鼠采自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，選取出生后 5 周齡昆明種雄鼠。在 Genebank 查找到小鼠基因 K26（Gene ID：NM_001033397）及 KAP26.1（Gene ID：NM_027105.2）序列，根據目的基因序列設計引物，將質粒轉入生長狀態(tài)良好的 293T 細胞，構建小鼠 K26 和 KAP26.1 基因慢病毒過表達載體，將含有目的基因 K26 及 KAP26.1 的慢病毒表達載體分別轉染小鼠皮膚成纖維細胞，用熒光顯微鏡觀察其轉染情況，確定慢病毒表達載體轉染成功后，從病毒感染后的細胞中抽提總 RNA，將 RNA 反轉錄成 cDNA后放入 Eppendorf Realplex 熒光定量 PCR 儀，檢測 K26 和 KAP26.1 基因過表達對 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因表達的影響。【結果】經 RT-PCR 檢測，證明小鼠慢病毒載體 pLenti6.3-K26-IRES-EGFP 和 pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP 構建成功。經熒光場對比，發(fā)現目的慢病毒載體轉染293T細胞 72h 時轉染率最高。經 PCR 檢測，證實包裝好的目的慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉染小鼠成纖維細胞 72 h 后轉染成功。經 RT-PCR 檢測 與 SPSS Statistics 19 軟件分析目的基因表達量與陽性對照組（空載體質粒組，BLACK）、陰性對照組（小鼠表皮成纖維細胞，NC）表達量之間的顯著性差異，發(fā)現 K26 基因過表達會導致 KAP26.1 基因上調，反之亦然，說明 K26 和 KAP26.1 基因之間存在一定的協同作用；K26 和 KAP26.1 基因過表達后，均能導致 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因下調；K26 基因過表達能使 BMP-4 基因表現為上調，而 BMPR-IB 基因表現為下調；KAP26.1 基因過表達時，BMP-4 和BMPR-IB 基因均表現為上調?！窘Y論】K26 與 KAP26.1 基因在毛囊的內根鞘中起到協同作用，K26和KAP26.1 基因的高表達會抑制 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因的表達，影響 mTOR 下游蛋白合成信號，進而起到調節(jié)絨毛粗細的作用；K26 和 KAP26.1 基因過表達均能使 BMP-4 基因表現為上調，BMP-4 是 BMP 信號通路的激活劑，能夠激活 BMP 信號通路向下游轉導，進而影響到毛囊的發(fā)育周期； K26 基因過表達下調 BMPR-IB 基因的表達，而 KAP26.1 基因過表達上調 BMPR-IB 基因的表達，BMPR-IB 基因是 BMP 信號的Ⅰ型受體，當 BMPR-IB 受體減少時，會抑制 BMP 信號向下游轉導，從而使絨毛生長周期重新開始；當 BMPR-IB 受體增加時，會促進下游信號分子轉錄，進而影響毛囊發(fā)育周期。說明 K26 和 KAP26.1 基因過表達均能激活 BMP 信號通路，并由 BMP 和mTOR 信號調節(jié) KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因的表達，但 K26 與 KAP26.1 基因對BMPR-IB 基因的相反調節(jié)作用有待深入研究。

慢病毒介導；K26/KAP26.1 基因；角蛋白關聯蛋白基因；BMP信號通路

0 引言

【研究意義】利用慢病毒介導過表達技術，明確小鼠 K26 和 KAP26.1 基因過表達后對角蛋白關聯蛋白基因 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因 BMP-4、BMPR-IB 的影響，探究小鼠絨毛細度變化的影響機制。角蛋白（keratin）與角蛋白關聯蛋白（KAPs）是哺乳動物毛發(fā)纖維的主要組成成分，能夠維持毛囊的結構，同時也是毛囊中表達最豐富的蛋白質[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是轉化生長因子-β （transforming growth factor-β, TGF-β）超家族中最大的分泌信號傳導分子家族[2]，其作用廣泛，不僅能影響動物不同時期的生長發(fā)育以及骨骼的形成，也是毛囊發(fā)育所涉及的信號分子之一[3-5]。角蛋白、角蛋白關聯蛋白及骨形態(tài)發(fā)生蛋白在哺乳動物皮膚細胞中的表達情況對哺乳動物絨毛品質有重要影響，可以通過人為調控（如慢病毒載體技術）使其中部分基因過表達，實現提高動物絨毛品質的目的，本研究對畜牧業(yè)生產具有重要的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】NANASHIMA等證明了角蛋白基因 K2-K25 參與鼠的毛發(fā)生長過程[6]。王杰等發(fā)現，角蛋白關聯蛋白基因 KAP6.2 與羊毛細度存在相關性[7]；MICHAEL 等發(fā)現角蛋白關聯蛋白基因 KAP7.1，KAP8.2 特異表達于人皮膚毛囊中，可能與毛發(fā)結構的分化有關[8]；金梅等研究發(fā)現角蛋白基因 K26 在遼寧絨山羊毛囊內根鞘上表達[9]，并在絨山羊皮膚細胞中發(fā)現了 K26，KAP26.1，KAP6.2，KAP7.1，KAP8.2 、KAP11.1 等基因的表達，經生物信息學分析證實，這些基因對絨毛纖維直徑具有重要的調節(jié)作用[10]。SHUNSUKE 等發(fā)現角蛋白關聯蛋白基因 KAP11.1 可能影響鼠的毛發(fā)結構[11]；ROGERS等研究發(fā)現，K26.1 基因與人的毛囊生長發(fā)育有關[12]。田月珍等應用基因多態(tài)性技術分析內蒙古細毛羊發(fā)現，K26 基因是調節(jié)羊絨細度性狀的分子標記[13]。然而，上述角蛋白及角蛋白關聯蛋白基因間相互作用關系的報道卻不多。BMP-4 和BMPR-IB 基因屬于 TGF-β 超家族成員，與毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和分化密切相關[14-15]；毛青青等以皮膚組織中構建 BMP-4 基因的 siRNA 轉基因小鼠為研究對象，發(fā)現 BMP-4 基因下調，小鼠毛囊數量增加，表明 BMP-4 基因抑制了毛囊形成[16]；樊振華等的研究證實BMP-4和BMPR-IB為羊和小鼠保守基因[17-18]。BMP 信號通路在毛囊生長發(fā)育方面應用較為經典，其路徑為 BMP 與絲氨酸/蘇氨酸受體磷酸化位點結合，信號轉導到核內與 Smad1、Smad5 和 Smad8 結合，進而誘導下游信號分子轉錄。BMP-4 與 Wnt 信號通路中的 LRP-6 特異性結合能夠促進 DKK3 高表達，從而激活毛發(fā)的生長周期，促進毛發(fā)生長[19]。DENG 等對人的毛囊再生研究中發(fā)現，mTOR complex 1（mTORC1）信號通路在毛囊干細胞中被激活，mTORC1 多個下游信號使毛囊發(fā)育自發(fā)進入生長期，如果將 mTORC1 信號抑制，毛囊將始終保持休止期[20]；相反，BMP 信號通路從休止期開始到休止期后期由強變弱，到達臨界值后，能夠維持毛囊干細胞靜止，為毛發(fā)再生做準備[21-22]。因此可以得知，mTOR 信號通過抑制 BMP 信號，使毛囊干細胞激活，進入毛囊生長期，實現毛發(fā)再生，說明毛囊生長發(fā)育是多方信號相互作用產生的結果。慢病毒載體和其它病毒載體相比具有免疫原性弱，同時又能夠轉導非分裂相的細胞的優(yōu)點，并能在宿主細胞內穩(wěn)定表達。慢病毒載體技術應用廣泛，已經成為生物及醫(yī)學等領域較為重要的實驗方法。YAMAGUCHI等通過實驗驗證慢病毒載體比逆轉錄載體具有更高的轉染效率[23]。ZHANG 等研究了慢病毒載體干擾 TNF-α 上調PRDX6，其中 PRDX6 可以提高大鼠雙側后肢的運動功能，為臨床治療脊椎損傷疾病提供新的方法[24]。還有學者研究發(fā)現通過制作含缺陷整合酶慢病毒載體的疫苗能夠抑制腫瘤細胞的生長，并能將小鼠體內的腫瘤消除，為人類治療腫瘤提供了新的途徑[25]?！颈狙芯壳腥朦c】大量的研究證明，角蛋白和角蛋白關聯蛋白家族基因，以及 BMPs 及其所介導的信號通路都與毛囊的發(fā)育過程以及毛發(fā)的生長情況密切相關，但是其間的相互影響及作用結果卻還未知。【擬解決的關鍵問題】本研究分別構建小鼠 K26 和 KAP26.1基因的慢病毒表達載體，將含有目的基因 K26 及KAP26.1 的慢病毒表達載體分別轉染小鼠皮膚成纖維細胞，檢測 K26 和 KAP26.1 基因過表達對KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因表達的影響，為角蛋白及角蛋白關聯蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因間相互聯系的研究奠定基礎，并對畜牧養(yǎng)殖過程中提高動物絨毛品質的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

293T 細胞（吉瑪生物技術有限公司，上海），PLenti6.3-MCS 質粒（銳賽生物技術有限公司，上海），DH5α感受態(tài)細胞（全式金生物技術有限公司，大連），培養(yǎng)基 DMEM + 10% FBS + 1% P/S + 1% Glutamax（銳賽生物技術有限公司，上海），慢病毒包裝質粒Mix（Invitrogen，美國），反轉錄試劑盒（takara公司，大連）。

1.2 皮膚樣品采集及細胞培養(yǎng)

試驗于2015年10月，在遼寧省生物技術與分子藥物研發(fā)重點實驗室完成。樣品采自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，于秋季選取出生后 5 周齡昆明種雄性小白鼠 5 只。初步滅菌后分別在其頸部（多毛區(qū)）剪取約 2 cm2的皮膚組織，用手術剪把皮膚塊剪至 1mm3。用組織塊貼附法原代培養(yǎng)小鼠細胞，接種皮膚塊 20 瓶。而后將培養(yǎng)瓶轉移到培養(yǎng)箱內，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞在瓶內長到 70%—80% 左右，進行傳代，待傳到第三代細胞穩(wěn)定后用于試驗。

1.3 小鼠目的基因的過表達慢病毒包裝及測定

1.3.1 質粒準備 將測序正確的 pLenti-K26-IRESEGFP（pLenti-KAP26.1-IRES-EGFP）和菌液劃線培養(yǎng)，挑單克隆接入含 Amp 的 LB，30℃ 搖菌過夜。用AXYGEN 質粒中抽提試劑盒進行質粒抽提。測定質粒濃度。

1.3.2 細胞準備 轉染前一天，取生長狀態(tài)良好的293T 細胞，棄舊培養(yǎng)液，加入 PBS 溶液洗滌細胞生長面，棄去 PBS 溶液。每皿加入 1 mL 胰酶消化液，消化約 1 min 直到細胞收縮變圓，吸棄胰酶，加入 3 mL DMEM + 10% FBS 培養(yǎng)基，吹打數次，將皿底的細胞沖洗下來，重懸均勻。5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約 24 h。

1.3.3 慢病毒包裝 在 GenBank 查找到小鼠基因K26（Gene ID：NM_001033397）及 KAP26.1（Gene ID：NM_027105.2）序列，根據目的基因序列設計引物，并在引物片段上下游分別添加酶切位點 PacI 和AscI，序列見表1。以PUC57-K26 及 PUC57-KAP26.1分別為模板進行 PCR 擴增目的片段，在目的片段兩端添加酶切位點 PacI 和 AscI，PCR 擴增其序列。37℃ 酶切 4—5 h 后，電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。T4 DNA ligase 連接上述酶切后的 PCR 產物及目的載體。將 10 μL 連接產物轉化 DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐（Amp）抗性的 LB 平皿，37oC培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進行 PCR 擴增。將 PCR鑒定呈陽性的克隆接到 LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質粒。將菌落 PCR 呈陽性的質粒進行酶切鑒定，將菌落 PCR 和酶切鑒定均呈陽性的克隆測序并進行序列比對。

1.3.4 病毒收獲與濃縮 轉染后 48 h，收集 293T細胞上清液，4°C 暫存。細胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至 72—80 h，收集病毒上清液，與第一次收集的混合，共 300 mL，于 4°C 3 000 r/min 離心10 min，除去細胞碎片。以醋酸纖維素膜的濾器過濾上清液于離心管中，4°C 22 000 r/min 離心 2 h。離心完畢后，小心取出離心管，棄上清液，每管用預冷的DMEM 基本培養(yǎng)基溶解沉淀。待病毒沉淀溶解完全后收集至 EP 管后分裝，-80°C 保存。

1.3.5 慢病毒滴度測定（qPCR 法） 感染前一天，用胰酶消化細胞并計數，準備 5×105細胞/mL 的293T 細胞接種 24 孔板，每孔 0.5 mL。細胞接種后第二天，根據病毒的預期滴度，準備 3 個無菌的 EP管，10 倍倍比稀釋慢病毒濃縮液。13 μL 慢病毒原液+ 117 μL DMEM → 10-1病毒液 13 μL 10-1病毒液+ 117 μL DMEM → 10-2病毒液 13 μL 10-2病毒液+ 117 μL DMEM → 10-3病毒液 13 μL 10-3病毒液+ 117 μL DMEM → 10-4病毒液 細胞換液，每孔內加入 400 μL 無抗生素的 DMEM + 10 % FBS 培養(yǎng)液，除對照組外其余各孔均加入 polybrene 至終濃度為 8 μg·mL-1。各感染孔內分別加入相應稀釋度的病毒液及病毒原液 100 μL，放入 37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內。感染 24 h后，換液，每孔內加入 500 μL DMEM + 10% FBS + 1% P/S + 1% Glutamax，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱內。感染 72 h 后，每孔加 500 μL Trizol 裂解細胞，抽提RNA，經 DNase I 處理后將 RNA 反轉錄成 cDNA，qPCR 檢測 WPRE 基因表達。

表1 目的基因引物Table 1 Primers of target gene

1.4 目的病毒及陰性對照慢病毒感染目的細胞

將細胞懸液接種于 6 孔培養(yǎng)板中（20 W 個/孔），37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據病毒滴度向細胞中分別加入適量的目的病毒和陰性對照病毒（MOI=30），同時加入終濃度為 8μg·mL-1的polybrene 增強感染 。感染 24 h 后更換無慢病毒的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染 72 h 后觀察慢病毒。

1.5 從病毒感染后的細胞中抽提總 RNA

將培養(yǎng)液去除后，用 PBS 潤洗細胞；向培養(yǎng)板中加入 Trizol，使裂解液均勻分布于細胞表面，然后用移液槍吹打細胞使細胞脫落；將細胞裂解液轉移至離心管中，并用槍頭反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀，在室溫下放置 5 min，使核酸蛋白復合物完全分離；每管加入 200 μL 氯仿，上下顛倒 EP 管 15 s，然后室溫靜置 15 min；4℃ 12 000 r/min離心 15 min；吸取上清液移至新的 1.5 mL lep 管，加入等體積 -20℃ 預冷的異丙醇，混勻后 -20℃ 沉淀 10 min；4℃ 12 000 r/min 離心 10 min；去上清液，加入1 mL 4℃ 預冷的 75% 乙醇，洗滌沉淀；4℃ 10 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，室溫干燥；加入 20 μL RNase-free 水，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA 的濃度。

1.6 RNA 反轉錄成 cDNA

使用Trizol（takara公司）試劑提取提取目的基因總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照RT-PCR（寶生物公司）試劑盒說明書進行反轉錄。

1.7 Real-time PCR 檢測目的基因

使用Trizol試劑盒（Takara公司）提取目的基因總RNA 并 DNAse I處理，再按照RT-PCR試劑盒說明書（Takara公司）將RNA反轉錄成cDNA。進行熒光定量PCR反應，每個樣本均做3個重復，引物序列如表2所述，試驗前在普通PCR上進行試驗條件的優(yōu)化，包括退火溫度和引物濃度等。

2 結果

2.1 小鼠目的基因載體構建

通過 RT-PCR 檢測小鼠 K26 及 KAP26.1 基因慢病毒載體構建情況，發(fā)現目的基因的 PCR 擴增位置（圖 1）與 PacI 和 AscI 對重組載體質粒雙酶切后的擴增位置一致（圖 2），即 K26 目的條帶的位置在 1 421 bp，K26.1 目的條帶的位置在 647 bp，結果表明小鼠慢病毒載體 pLenti6.3-K26-IRES-EGFP 和 pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP 構建成功。

表2 目的基因引物Table 2 Primers of target gene

2.2 小鼠目的基因的過表達慢病毒包裝

轉染前 293T 細胞在顯微鏡明場下呈扁平形（圖3-A）；在熒光場下無熒光，（圖3-B）。以 Lenti-IRESEGFP NC 轉染 293T 細胞為對照組（圖 3-C 和D），對比熒光場對照組細胞，K26 及 KAP26.1 慢病毒載體分別成功轉染 293T 細胞熒光場出現熒光，結果表明小鼠 K26 及 KAP26.1 慢病毒包裝成功（圖3-H 和 L）。本試驗對轉染慢病毒載體感染時間進行驗證，目的慢病毒轉染 72 h 的轉染率遠遠高于 48 h的轉染率，說明目的慢病毒載體轉染293T細胞72 h轉染最好（圖3-E—L）。

將包裝好的目的慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉染小鼠成纖維細胞 72 h 后（圖 4），分別提取其總的RNA，反轉錄成 cDNA 后，PCR 證實 K26 病毒及KAP26.1 病毒轉染小鼠成纖維細胞成功（圖 5）。

從慢病毒感染后小鼠皮膚成纖維細胞中 K26 和KAP26.1 基因的表達檢測結果來看，小鼠 K26 和KAP26.1 基因過表達效果明顯，說明兩個基因的慢病毒質量合格，感染細胞效果正常。

圖1 目的片段的 PCR 擴增Fig. 1 PCR Amplification of target gene

圖2 重組克隆的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant clones by restriction enzyme digestion

2.3 小鼠目的基因過表達后對其他相關基因的影響

通過實時熒光定量 PCR 測得目的基因的 Ct值，根據 2-ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達量，并計算其標準差，用 SPSS Statistics 19 軟件分析目的基因表達量與陽性對照組（空載體質粒組，BLACK）、陰性對照組（小鼠表皮成纖維細胞，NC）表達量之間的顯著性差異（圖 6和7）。

如圖6結果所示，當K26基因過表達后，KAP26.1基因與陽性對照組（空載體質粒組，BLACK）、陰性對照組（小鼠表皮成纖維細胞，NC）相比，表達量顯著升高（P＜0.01）；BMPR-IB、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達與對陽性和陰性對照組相比明顯降低；BMP4 基因的表達與陽性對照組相比差異不大，但是與陰性對照組相比明顯升高；KAP6.2 基因的表達與陽性對照組相比無差異，但是與陰性對照組相比明顯降低?？傮w看來，當 K26 基因過表達后，BMPR-IB、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達下調，BMP4 基因的表達上調。如圖 7 結果所示，當 KAP26.1 基因過表達后，K26基因表達量明顯升高 （0.01＜P＜0.05），KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達明顯下調，BMP4 和BMPR-IB 基因的表達明顯上調。

圖3 慢病毒載體轉染 293T 細胞Fig. 3 Lentiviral vector was transfected into 293T cells ( ×100 )

圖4 慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉染小鼠成纖維細胞 72 hFig. 4 Lentivirus K26 and KAP26.1 were transfected into mice fibroblasts for 72 h

圖5 PCR 電泳圖Fig. 5 PCR electrophoresis

圖6 K26基因過表達對其它相關基因表達量的影響Fig. 6 Effects of K26 gene overexpression on the other related genes

3 討論

3.1 K26 和 KAP26.1 基因過表達

角蛋白和角蛋白關聯蛋白兩類家族基因定位在同一物種不同的染色體上，經過基因序列比對，發(fā)現它們基因排序的相似度極高，說明這兩類基因是同源性較高的保守基因[26-30]。結果表明，角蛋白基因 K26及角蛋白關聯蛋白基因 KAP26.1 均在小鼠皮膚成纖維細胞中表達，K26 過表達后，KAP26.1 表達量相對上調；相應地，KAP26.1 過表達后，K26 表達量也相對上調，說明 K26 及 KAP26.1 基因在小鼠皮膚成纖維細胞中存在協同關系。

圖7 KAP26.1 基因過表達對其它相關基因表達量的影響Fig. 7 Effects of KAP26.1 gene overexpression on the other related genes

有研究表明，Ⅰ 型角蛋白（如 K17）和 Ⅱ 型角蛋白集群（如 K1、K2、K5、K6a、K6b、K7、K8、K18、K71-K74和K76-K84）的減少，均能影響mTOR下游蛋白合成信號，導致角質細胞內的總蛋白合成減少[31-32]。因此可以推測，K26與KAP26.1基因過表達會促進mTOR下游合成蛋白信號，從而增加細胞內蛋白合成。還有研究表明，K26與KAP26.1基因均在毛囊內根鞘表達，參與調控不同種羊毛纖維細度[9,12-13]。由此可以通過生物技術調控動物皮膚細胞中 K26和KAP26.1基因的表達量，達到人為調控哺乳動物毛發(fā)直徑的目的。

3.2 K26 和 KAP26.1 基因過表達對其它角蛋白關聯蛋白的影響

K26和 KAP26.1基因過表達后，均能導致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因表達下調，說明在小鼠皮膚成纖維細胞中，K26、KAP26.1、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因存在動態(tài)的平衡關系，K26 和KAP26.1基因的高表達會抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因的表達，以恢復平衡狀態(tài)，這種變化的機制由特定的信號通路調節(jié)。

前人研究結果表明，KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2 和KAP11.1 參與了絨毛的形成，對絨毛細度有調控作用，K26 及 KAP26.1 基因在毛囊生長不同時期的表達差異極其顯著，對毛囊的周期性變化具有十分重要的調節(jié)作用。因此，可以通過外源干擾，在毛囊發(fā)育的不同時期利用 K26 及 KAP26.1 基因過表達對其它基因的影響調控絨毛細度。

3.3 K26 和 KAP26.1 基因過表達對 BMP 信號通路的影響

K26 和 KAP26.1 基因過表達均能使 BMP-4 基因表現為上調。BMP-4 是 BMP 信號通路的激活劑，激活 BMP 信號通路向下游轉導，因此 K26 和KAP26.1 基因過表達均能激活 BMP 信號通路?？梢酝茢?，K26 和 KAP26.1 位于 BMP 信號通路的上游。KULESSA等研究發(fā)現，BMP 信號在毛囊休止期起主要作用[33]。因此，K26 或 KAP26.1 基因通過上調 BMP-4 基因，激活 BMP 信號通路，進一步影響到毛囊的發(fā)育周期。

K26 與 KAP26.1 基因對 BMPR-IB 基因的表達產生不同作用，K26 基因過表達會下調 BMPR-IB基因的表達，而 KAP26.1 基因過表達會上調BMPR-IB 基因的表達。BMPR-IB 基因是 BMP 信號的Ⅰ型受體，當 BMPR-IB 受體減少時，會抑制 BMP信號向下游轉導，從而使絨毛生長周期從新開始；當BMPR-IB 受體增加時，會促進下游信號分子轉錄，進而影響毛囊發(fā)育周期。K26 與 KAP26.1 基因對BMPR-IB 作用影響的機制有待深入研究，期望通過揭示這一機制為研究哺乳動物毛囊生長周期調節(jié)機制提供新的證據。

4 結論

K26和KAP26.1基因位于角蛋白關聯蛋白KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因和骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-4、BMPR-IB 基因的上游，間接參與 mTOR 與BMP 信號通路。 K26 與 KAP26.1 之間存在一定的協同作用，K26 與 KAP26.1 過表達均可間接抑制mTOR 信號通路，從而影響小鼠絨毛粗細程度；K26 與 KAP26.1 過表達均可間接激活 BMP 信號通路，從而調控小鼠毛囊發(fā)育周期。所以，可以通過人為調控哺乳動物皮膚細胞中 K26 和 KAP26.1 基因的表達，達到改善絨毛質量的目的。

[1] SHIMOMURA Y, AOKI N, SCHWEIZER J, LANGBEIN L, ROGERS M A, WINTER H, ITO M. Polymorphisms in the human high sulfur hair keratin-associated protein 1, KAP1, gene family. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(47): 45493- 45501.

[2] CHEN D, ZHAO M, MUNDY G R. Bone morphogentic proteins. Growth Factors, 2004, 22(4): 233-241.

[3] O’SHAUGHNESSY R F, CHRISTIANO A M. Stem cells in the epidermis. Skin Pharmacology Applied Skin Physiology, 2001, 14(6): 350-357.

[4] 蘇蕊, 李金泉, 張文廣. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 (BMP2) 基因在內蒙古絨山羊不同時期皮膚毛囊中的表達. 中國農業(yè)科學, 2008, 41(2): 559-563. SU R, LI J Q, ZHANG W G. Bone morphogenetic proteins 2 (BMP2) gene express in Inner Mongolia goat skin hair follicle in different periods. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(2): 559-563. (in Chinese)

[5] 殷金鳳, 倪蓉, 王慶增, 孫偉, 丁家桐, 張有法, 陳玲, 吳文忠, 周洪. 湖羊 BMP7 基因遺傳多態(tài)、表達及與羔皮毛囊性狀的關聯.中國農業(yè)科學, 2014, 47(9): 1811-1818. YIN J F, NI R, WANG Q Z, SUN W, DING J T, ZHANG Y F, CHEN L, WU W Z, ZHOU H. The genetic polymorphism, expression of Hu Sheep BMP7 gene and relation with lamb skin hair follicle traits. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(9): 1811-1818. (in Chinese)

[6] NANASHIMA N, AKITA M, YAMADA T, SHIMIZU T, NAKANO H, YANG F, TSUCHIDA S. The Hairless Phenotype of the Hirosaki Hairless Rat Is Due to the Deletion of an 80-kb Genomic DNA Containing Five Basic Keratin Genes. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(24): 16868-16875.

[7] 王杰, 代怡婧, 王永, 字向東, 歐陽熙, 劉魯蜀. 高原型藏山羊KAP6.2 和 6.2 位點與產絨性狀的關系研究. 西南民族大學學報(自然科學版), 2010, 36(6): 962-966. WANG J, DAI Y J, WANG Y, ZI X D, OU Y X, LIU L S. The study on the relation between Plateau Type Tibetan goat KAP6.2 and 6.2 loci and the production wool traits. Journal of Southwest University for Nationalities (Natural Science Edition), 2010, 36(6): 962-966. (in Chinese)

[8] ROGERS MA, LANGBEIN L, WINTER H, BECKMANN I, PRAETZEL S, SCHWEIZER J. Hair Keratin Associated Proteins: Characterization of a Second High Sulfur KAP Gene Domain on Human Chromosome 21. The Journal of Investigative Dermatology, 2004, 122(1): 147-158.

[9] JIN M, XING M, Li S. Keratin 26, a novel member of the goat type I keratin gene family. Small Ruminant Research, 2010, 93(1): 24-30.

[10] JIN M, XING M, Li S, XING M X, ZHANG X. Characterization and expression analysis of KAP7.1、KAP8.2 gene in Liaoning new-breeding cashmere goat hair follicle. Molecular Biology Reports, 2011, 38(5): 3023-3028.

[11] FUJIMOTO S, TAKASE T, KADONO N, MAEKUBO K, HIRAI Y. Krtap11-1, a hair keratin-associated protein, as a possible crucial element for the physical properties of hair shafts. Journal of Dermatological Science, 2014, 74(1): 39-47.

[12] ROGERS MA, LANGBEIN L, PRAETZEL S, GIEHL K. Characterization and expression analysis of the hair keratin associated protein KAP26.1. British Journal of Dermatology, 2008, 159(3): 725-729.

[13] 田月珍, 黃錫霞, 田可川. 細毛羊 KRT26 基因多態(tài)性及其與羊毛細度的關聯性分析. 中國畜牧獸醫(yī), 2015, 42(1): 161-166. TIAN Y Z, HUANG X X, TIAN K C. Fine-wool sheep KRT26 gene polymorphism and correlation analysis with wool fineness. Chinese journal of Animal and Veterinary Sciences, 2015, 42(1): 161-166. (in Chinese)

[14] 李榮, 尹俊, 劉羿羿, 張燕軍, 劉志紅, 席海燕, 張俊霞, 李金泉. BMPR-IB 基因在內蒙古絨山羊皮膚毛囊中的表達. 中國草食動物科學, 2006(z1): 72-73. LI R, YIN J, LIU Y Y, ZHANG Y J, LIU Z H, XI H Y, ZHANG J X, LI J Q. The BMPR-IB gene expression in Inner Mongolia goat skin hair follicles. China Herbivores Science, 2006(z1): 72-73. (in Chinese)

[15] SCHMIDT R, PAUS R. Molecular principles of hair follicle induction and morphgenesis. Biology Essays, 2005, 27(3): 247-261.

[16] 毛青青, 代蓉, 沈思軍, 郭洪, 萬鵬程, 周平, 石國慶. BMP-4 對小鼠毛囊數量的影響. 西北農業(yè)學報, 2012, 21(6): 13-17. MAO Q Q, DAI R, SHEN S J, GUO H, WAN P C, ZHOU P, SHI G Q. The impact of BMP-4 on the number of mice follicles. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2012, 21(6): 13-17. (in Chinese)

[17] 樊振華, 張秋月, 范瑞文, 任玉紅. 綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4 (BMP4)的生物信息學分析. 中國畜牧獸醫(yī)學報, 2015, 42(6): 1370-1376. FAN Z H, ZHANG Q Y, FAN R W, REN Y H. The bioinformatics analysis of sheep bone morphogenetic proteins 4 (BMP4). Chinese journal of Animal and Veterinary Sciences, 2015, 42(6): 1370-1376.(in Chinese)

[18] 李榮. 內蒙古絨山羊 BMP-4、BMPR-IB 基因 cDNA 的克隆及BMPR-IB 在皮膚毛囊中的表達[D]. 呼和浩特: 內蒙古農業(yè)大學, 2007. LI R. The cDNA cloning of Inner Mongolia goat BMP-4, BMPR-IB gene and the BMPR-IB expression in hair follicles[D]. Huhhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2007. (in Chinese)

[19] 王洪濤, 陳璧, 胡大海, 陶克, 丁國斌, 湯朝武. 人胎兒毛囊隆突細胞的培養(yǎng)方法及其向皮脂腺細胞誘導分化的初步研究. 中華燒傷雜志, 2006, 22(3): 199-202. WANG H T, CHEN B, HU D H, TAO K, DING G F, TANG C W. The preliminary study on the cultivation method of human fetal hair follicle juga cells and induce the sebaceous gland cells differentiation. Chinese Journal of Burns, 2006, 22(3): 199-202. (in Chinese)

[20] DENG Z, LEI X, ZHANG X. mTOR signaling promotes stem cell activation via counterbalancing BMP-mediated suppression during hair regeneration. Journal of Molecular Cell, 2015, 7(1): 62-72.

[21] MAKSIM V. PLIKUS, JULIE A M, DAMON C, RUTH E. BAKER, PHILIP K. MAINI, ROBERT M, CHENG M C. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature, 2008, 451(7176): 340-344.

[22] OSHIMORI N, FUCHS E. Paracrine TGF-beta signaling counterbalances BMP-mediated repression in hair follicle stem cell activation. Cell Stem Cell, 2012, 10(1): 63-71.

[23] YAMAGUCHI, MORIKAWA A, MIYOSHI H. Comparison of gene-trapping efficiency between retroviral and lentiviral vectors in mouse embryonic stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 425(2): 297-303.

[24] ZHANG X, SHI L L, GAO X, JIANG D, ZHONG Z Q, ZENG X, RAO Y, HU X, LI T Z, LI X J, LI L, CHEN J M, XIA Q J, WANG T H. Lentivirus-mediated Inhibition of Tumour Necrosis Factoraimproves motor function associated with PRDX6 in spinal cord contusion rats. Scientific Reports, 2015, 5: 8486.

[25] GRASSO F, DONATELLA R M. NEGRI, ROSSI A, CESOLINI A, GIOVANNELLLI A, CHIANTORE M V, LEONE P, GIORGI C, CARA A. Successful therapeutic vaccination with integrase defective lentiviral vector expressing nononcogenic human papillomavirus E7 protein. International Journal of Cancer, 2013, 132(2): 335-344.

[26] ROGERS MA, LANGBEIN L, WINTER H, EHMANN C, PRAETZEL S, SCHWEIZER J. Characterization of a first domain of human high glycine-tyrosine and high sulfur keratin associated protein(KAP)genes on chromosome 21q22.1. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(50): 48993-49002.

[27] ROGERS MA, WINTER H, LANGBEIN L, WOLLSCHLAGER A, PRAETZEL S, JAVE LF, SCHWEIZER J. Characterization of human KAP24.1, a cuticular hair keratin associated protein with unusual amino-acid composition and repeat structure. Journal of Investigative Dermatology, 2007, 127(5): 1197-1204.

[28] SCHWEIZER J, BOWDEN P E, COULOMBE P A, LANGBEIN L, LANE E B, MAGIN T M, MALTAIS L, OMARY M B, PARRY D A, ROGERS M A, WRIGHT M W. New consensus nomenclature for mammalian keratins. The Journal of Cell Biology, 2006, 174(2): 169-174.

[29] KHAN I, MALDONADO E, VASCONCELOS V, O’BRIEN S J, JOHNSON W E, ANTUNES A. Mammalian keratin associated proteins (KRTAPs) subgenomes: disentangling hair diversity and adaptation to terrestrial and aquatic environments. BMC Genomics, 2014, 15(1): 1-19.

[30] PRUETT N D, TKATCHENKO T V, JAVE L, JACOBS D F, POTTER C S, TKATCHENKO A V, SCHWEIZER J, AWGULEWITSCH A. Krtap16, characterization of a new hair keratin-associated protein (KAP) gene complex on mouse chromosome 16 and evidence for regulation by Hoxc13. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(49): 51524-51533.

[31] KIM S, WONG P, COULOMBE P A. A keratin cytoskeletal protein regulates protein synthesis and epithelial cell growth. Nature, 2006, 441(7091): 362-365.

[32] VIJAYARAJ P, KROGER C, REUTER U, WINDOFFER R, LEUBE RE, MAGIN TM. Keratins regulate protein biosynthesis through localization of GLUT1 and -3 upstream of AMP kinase and Raptor. The Journal of Cell Biology, 2009,187 (2): 175-184.

[33] KULESSA H, TURK G, HOGAN B L. Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle. EMBO Journal, 2000, 19(24): 6664-6674.

（責任編輯 林鑒非）

Regulation of Related Genes by Lentivirus-Mediated K26/KAP26.1 Gene Overexpression in Mice

JIN Mei, KANG Lin, SUN DongYu, PIAO Jun, PIAO JingAi, ZHAO FengQin
(Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery, College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116029, Liaoning)

【Objective】Using the lentivirus-mediated overexpression technique, the aims of this study were at determining the effects of K26 and KAP26.1 gene overexpression on keratin-associated protein genes KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1, and bone morphogenetic protein genes BMP4 and BMPR1B, and exploring the mechanism by which these genes influence hair fineness in mice, to achieve the goal of improving the quality of animal hair, to realize artificial regulation (such as lentivirus-mediated technology) of overexpression of some genes, and to lay a theoretical foundation for investigating the artificial regulation of mammalian hair fineness.【Method】In October, the experiment was conducted in Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery. The Kunming species mice aged five weeks were obtained from Experimental Animal Center of Dalian Medical University. The mice gene sequences of K26 (Gene ID: NM_001033397) and KAP26.1 (Gene ID: NM_027105. 2) were retrieved from Genbank, and the primers were designed according to the sequences of target genes. The healthy 293T cells were transfected with the plasmid to establish the vectors of mice K26 and KAP26.1 gene lentivirus overexpression, respectively, which were transfected into mice skin fibroblasts. Transfection efficiency was observed by quantitative fluorescence microscopy. After determining the success of lentivirus overexpression, the total RNA was extracted from the transfected cells, and after reverse transcription, the obtained cDNA was measured with the Eppendorf Realplex florescent quantitative PCR to detect the influence of K26 and KAP26.1 genes overexpression on KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, KAP11.1, BMP-4 and BMPR-IB gene expression 【Result】Proved by RT-PCR detection, mice lentivirus vectors pLenti6.3-K26-IRES-EGFP and pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP were established successfully. Compared by fluorescent field, the highest transfection rate of 293T cell transfected lentivirus vectors was reached after 72hr. Confirmed by PCR detection, packaged K26 and KAP26.1 lentivirus vectors transfected into mice fibroblast successfully after 72hr.Through RT-PCR detection and analyzed by SPSS 19 software, expression levels showed significant difference among the target genes, positive control group (empty plasmid, BLACK) and negative control group (mice skin fibroblasts, NC), indicating that after K26 overexpression, the expression level of KAP26.1 was up-regulated, and vice versa. This finding suggested synergy between K26 and KAP26.1. After K26 and KAP26.1 overexpression, the expression levels of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1 were down-regulated. After K26 overexpression, BMP4 gene expression increased, while BMPR1B gene expression decreased. After KAP26.1 overexpression, expression levels ofBMP4 and BMPR1B both were up-regulated. 【Conclusion】 K26 and KAP26.1 genes had a synergistic effect on the inner root sheath of the hair follicle by influencing the downstream protein synthesis signal of mTOR pathway. The high expression of K26 and KAP26.1 genes could inhibit the expression of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1 genes and thereby regulated hair fineness. Both K26 and KAP26.1 overexpression could up-regulate the expression level of BMP-4 gene which is the activator of BMP signaling pathway and could activate the BMP signaling pathway and then affected the growth of hair follicle cycle. K26 gene overexpression could down-regulate BMPR-IB gene expression, while KAP26.1 gene overexpression up-regulate BMPR-IB gene expression. BMPR-IB gene is the receptor I of the BMP signal. When BMPR-IB receptors decreased, the BMP downstream signal transduction will be inhibited, and then restarted hair growth cycle. When BMPR-IB receptors increased, the downstream signaling molecules transcription will be promoted, and then affected hair follicle growth cycle. Both K26 and KAP26.1 overexpression could activate BMP signaling pathway, and the expressions of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, KAP11.1,BMP-4 and BMPR-IB genes were in turn regulated by the mTOR and BMP signaling pathways. But the opposite regulation effects of K26 and KAP26.1 genes on BMPR-IB gene still need to be further explored.

lentivirus-mediated; K26/KAP26.1 gene; keratin-associated protein gene; BMP signaling pathway

2016-04-28；接受日期：2016-11-03

國家自然科學基金（31172188）、大連市科技計劃（2013B12NC090）、遼寧省教育廳科研項目(L201683652)聯系方式：金梅，E-mail：jm6688210@163.com。通信作者趙鳳琴，E-mail：eco-env@163.com