劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，牛憨笨

深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東深圳 518060

【光電工程 / Optoelectronic Engineering】

CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率標(biāo)定

劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，牛憨笨

深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東深圳 518060

空間分辨率是衡量相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering，CARS)顯微成像系統(tǒng)性能的一個(gè)重要指標(biāo). 選擇直徑為110 nm的聚苯乙烯微球進(jìn)行三維成像，根據(jù)各個(gè)點(diǎn)的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)形成的二維數(shù)組分別重構(gòu)了系統(tǒng)x-y平面和x-z平面的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，準(zhǔn)確測(cè)試了自行搭建的CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向空間分辨率約為484nm，軸向空間分辨率約為3.17μm．

光學(xué)工程；相干反斯托克斯拉曼散射；圖像重構(gòu)；點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)；空間分辨率；非線性光學(xué)；拉曼散射；信息光學(xué)

1965年， Terhune等[14]發(fā)現(xiàn)了CARS現(xiàn)象．1982年，Maker等[15]將該現(xiàn)象與光學(xué)顯微鏡結(jié)合起來(lái)發(fā)展了CARS顯微技術(shù)．1999年，謝曉亮課題組將CARS系統(tǒng)的激發(fā)光布局從非共線轉(zhuǎn)為共線，簡(jiǎn)化了CARS顯微成像系統(tǒng)，此后該技術(shù)迎來(lái)了快速發(fā)展并逐步走向?qū)嵱肹16-17]．CARS顯微成像技術(shù)將單點(diǎn)分析擴(kuò)展到對(duì)一定空間范圍內(nèi)具有結(jié)構(gòu)的樣品研究．該技術(shù)依靠逐點(diǎn)掃描獲得圖像，通過(guò)聚焦光斑與樣品間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，將樣品上每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度信息與位置信息一一對(duì)應(yīng)，可在無(wú)需標(biāo)記的前提下獲得反映分子某一特征化學(xué)鍵的空間分布信息，為人類提供了遠(yuǎn)超人眼所能看到的內(nèi)容，現(xiàn)已廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)對(duì)脂類和蛋白質(zhì)分子成像等領(lǐng)域．空間分辨率是衡量CARS成像系統(tǒng)性能的一個(gè)重要指標(biāo)[18]，本研究選取直徑為110 nm的聚苯乙烯微球進(jìn)行三維成像，重構(gòu)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)．根據(jù)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的半高全寬，獲得CARS顯微成像系統(tǒng)的三維空間分辨率．

1 CARS顯微成像系統(tǒng)搭建

CARS為非線性過(guò)程，當(dāng)中心頻率為ωL的泵浦光與中心頻率為ωS的斯托克斯光的頻率差恰好等于分子某一化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率ΩR時(shí)[19]，即ωL-ωS=ΩR， 共振激發(fā)產(chǎn)生頻率為ωA=ωP+ΩR的反斯托克斯信號(hào)，ωP為探測(cè)光中心頻率[20]，能級(jí)圖如圖1[21]．其中，g為振動(dòng)基態(tài)；v為振動(dòng)激發(fā)態(tài)．

圖1 CARS過(guò)程能級(jí)圖[21]Fig.1 Energy level diagram of CARS process[21]

CARS信號(hào)的產(chǎn)生至少需要兩束脈沖激光，其中一束既是泵浦光又是探測(cè)光[22-23]. 利用飛秒脈沖泵浦光學(xué)參量放大器(opticalparametricoscillator,OPO)作為波長(zhǎng)調(diào)諧的關(guān)鍵裝置[24]．脈沖激光器產(chǎn)生的光束一分為二，一路作為CARS系統(tǒng)的斯托克斯光，另一路泵浦OPO產(chǎn)生兩束與泵浦光脈沖時(shí)序完全一致、波長(zhǎng)可調(diào)諧的信號(hào)光與閑頻光， 通常只采用信號(hào)光作為CARS系統(tǒng)的泵浦光，與斯托克斯光共同激發(fā)樣品[25]．本研究采用美國(guó)Spectra-Physics公司的鈦寶石飛秒激光脈沖泵浦OPO．中心波長(zhǎng)為820nm，重復(fù)頻率為80MHz的飛秒脈沖倍頻后(中心波長(zhǎng)為410nm)作為OPO的泵浦源，產(chǎn)生的信號(hào)光波長(zhǎng)范圍為490～750nm，作為CARS成像系統(tǒng)的泵浦光．泵浦光與斯托克斯光的脈沖序列同步，通過(guò)光學(xué)時(shí)間延遲線可使脈沖精確重合，并通過(guò)顯微物鏡聚焦后共同作用于樣品．

選擇具有結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯分子，泵浦光與斯托克斯光頻差滿足聚苯乙烯分子苯環(huán)內(nèi)碳原子間非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的1 603cm-1振動(dòng)頻率，共振激發(fā)產(chǎn)生相應(yīng)波長(zhǎng)的CARS信號(hào)．鈦寶石飛秒激光泵浦OPO尚未耗盡的部分，即中心波長(zhǎng)為820nm的光作為斯托克斯光，調(diào)整OPO的信號(hào)光波長(zhǎng)至724nm，并同時(shí)作為泵浦光與探測(cè)光，產(chǎn)生的CARS信號(hào)中心波長(zhǎng)為648nm．飛秒激光光源的脈寬很窄，因此調(diào)節(jié)兩路脈沖精確重合的難度較大．本研究選擇由精密線性平臺(tái)和兩塊呈90°擺放的反射鏡組成的光學(xué)時(shí)間延遲線精確控制脈沖之間的延遲，控制精度可達(dá)7fs．同步后的兩束飛秒脈沖光經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的雙色鏡合束后共線輸入顯微物鏡，并調(diào)整激發(fā)光光軸與物鏡中心軸重合，以此保證在相同激發(fā)光功率下能夠獲得最大的信號(hào)強(qiáng)度．激光束通過(guò)數(shù)值孔徑為0.95的消色差顯微物鏡聚焦到樣品上，信號(hào)只產(chǎn)生于光功率密度較高的焦點(diǎn)處，并具有良好的方向性，可通過(guò)一個(gè)數(shù)值孔徑為0.85的聚光鏡收集，并通過(guò)一根單模光纖輸入至光譜儀中，系統(tǒng)示意如圖2．

圖2 CARS顯微成像系統(tǒng)示意圖Fig.2 Diagram of the CARS microscopy system

CARS信號(hào)通過(guò)大數(shù)值孔徑聚光鏡收集后由光纖輸入至光譜儀．通過(guò)聚焦光斑與樣品之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，通過(guò)軟件進(jìn)行圖像重構(gòu)后獲取一幅完整的CARS顯微圖像．聚焦光斑與樣品之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)由三維納米位移臺(tái)完成(型號(hào)為PI，P-545.3C7)，位移臺(tái)的移動(dòng)與光譜儀的數(shù)據(jù)采集需緊密配合方能完成樣品掃描過(guò)程．掃描過(guò)程中，當(dāng)納米位移臺(tái)沿x軸(假設(shè)x方向?yàn)榭燧S)正方向每移動(dòng)一步，并停留在此位置時(shí)，光譜儀馬上對(duì)該點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集并保存．納米位移臺(tái)繼續(xù)沿著x方向移動(dòng)至下一個(gè)采樣點(diǎn)，光譜儀再次完成數(shù)據(jù)采集，直至x方向上所有采樣點(diǎn)數(shù)據(jù)采集完畢．然后，納米位移臺(tái)沿y軸(假設(shè)y方向?yàn)槁S)移動(dòng)一步并采集該位置的光譜強(qiáng)度數(shù)據(jù)，隨后，納米位移臺(tái)沿x軸負(fù)方向逐步移動(dòng)并記錄每一位置處的光譜強(qiáng)度信息，依次循環(huán)直至完成整個(gè)樣品掃描和數(shù)據(jù)采集．樣品二維點(diǎn)掃描示意如圖3．其中藍(lán)點(diǎn)代表每1個(gè)位移臺(tái)駐留的每個(gè)位置；紅色虛線的箭頭方向代表位移臺(tái)的運(yùn)動(dòng)方向．按照上述掃描方式完成x-y平面的二維圖像掃描后，如需完成三維空間層析成像，納米位移臺(tái)沿z軸方向每運(yùn)動(dòng)1步，就在此面上掃描完成1幅x-y平面的二維二維圖像，直至掃描完成像區(qū)域的整個(gè)三維空間．CARS顯微成像系統(tǒng)可以獲得任意維度的二維圖像及三維層析圖像[26-27]．

掃描過(guò)程中，納米位移臺(tái)每移動(dòng)1步，光譜儀需要記錄1次光譜數(shù)據(jù)，兩者之間的聯(lián)動(dòng)決定了掃描過(guò)程能否完成．本研究根據(jù)廠家提供的開(kāi)發(fā)包編寫(xiě)了基于LabView虛擬儀器開(kāi)發(fā)軟件，實(shí)現(xiàn)了納米位移臺(tái)與光譜儀的自動(dòng)控制，使兩臺(tái)獨(dú)立運(yùn)行的儀器配合成一個(gè)整體實(shí)現(xiàn)自動(dòng)掃描．當(dāng)納米位移臺(tái)配合光譜儀完成一定空間范圍內(nèi)樣品的自動(dòng)掃描后，每個(gè)采樣點(diǎn)的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)將形成1個(gè)二維數(shù)組并存放于相同的路徑中，掃描過(guò)程記錄了每個(gè)采樣點(diǎn)的位置數(shù)據(jù)以及光譜數(shù)據(jù)．圖像重構(gòu)過(guò)程是一個(gè)卷積過(guò)程，即將具有一定空間結(jié)構(gòu)的樣品上的每個(gè)采樣點(diǎn)均以愛(ài)里斑來(lái)代替，而每個(gè)點(diǎn)采集的光譜數(shù)據(jù)做歸一化處理后對(duì)應(yīng)為灰度值．每個(gè)采樣位置點(diǎn)的光譜強(qiáng)度值作為整個(gè)愛(ài)里斑覆蓋區(qū)域(以圖3中虛線框范圍表示)平均強(qiáng)度．采用Matlab軟件編寫(xiě)了成像代碼，依次打開(kāi)指定路徑下保存的位置數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)文件，讀取每個(gè)采樣點(diǎn)的位置和光譜數(shù)據(jù)，可重構(gòu)具有一定灰度等級(jí)的CARS顯微圖像．

基于以上CARS顯微成像系統(tǒng)的搭建及控制程序、圖像重構(gòu)程序的編寫(xiě)，針對(duì)聚苯乙烯分子1 603cm-1的拉曼峰，采用泵浦光與斯托克斯光功率分別為2.3和0.5mW，完成直徑為1.37和4.60μm的聚苯乙烯微球的CARS顯微成像，結(jié)果如圖4．其中，圖4(a)為直徑1.37μm的聚苯乙烯微球的CARS顯微圖像，掃描的單步步長(zhǎng)為50nm，步數(shù)為70×70，幅面尺寸為3.5μm×3.5μm，成像耗時(shí)約12min；圖5(b)為直徑4.60μm聚苯乙烯微球的CARS顯微圖像，掃描步長(zhǎng)為0.2μm，掃描步數(shù)為100×100，幅面尺寸為20μm×20μm成像耗時(shí)約25min．

圖4 直徑分別為1.37和4.60 μm的聚苯乙烯微球CARS顯微圖像Fig.4 CARS images of polystyrene microballs with diameters of 1.37 and 4.60 μm respectively

3 CARS顯微成像系統(tǒng)空間分辨率

CARS屬于3階非線性過(guò)程，信號(hào)強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度呈正比，且只產(chǎn)生于光功率密度較高的焦點(diǎn)處．通過(guò)掃描一個(gè)尺寸遠(yuǎn)小于光波波長(zhǎng)的聚苯乙烯微球，根據(jù)掃描過(guò)程記錄的每個(gè)采樣點(diǎn)的位置數(shù)據(jù)、光譜數(shù)據(jù)重構(gòu)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，及該函數(shù)的半高全寬，得到CARS顯微成像系統(tǒng)的分辨率．實(shí)驗(yàn)中泵浦光中心波長(zhǎng)為724nm，斯托克斯光中心波長(zhǎng)為820nm，兩者頻差滿足聚苯乙烯分子1 603cm-1的振動(dòng)頻率，平均功率分別為1.5與7.5mW．

為重構(gòu)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，選擇尺寸遠(yuǎn)小于光波長(zhǎng)的110nm且單獨(dú)分布的聚苯乙烯微球進(jìn)行成像．110nm遠(yuǎn)小于光學(xué)顯微鏡的分辨率，目鏡下肉眼很難觀察到此微球分布狀態(tài)，因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中首先通過(guò)大步長(zhǎng)粗略掃描，采用圖像重構(gòu)方法得到一幅較大范圍內(nèi)微球排布狀況的CARS顯微圖像，然后根據(jù)此圖像選擇掃描起始位置和范圍，確定物鏡聚焦的位置是否需要調(diào)整．此外，為盡可能獲得呈單獨(dú)分布的微球，避免大量微球堆聚現(xiàn)象，樣品制備過(guò)程中需使少量微球平鋪到載玻片表面．在載玻片表面滴入純水，將聚苯乙烯球樣品滴到水面，依靠液體表面張力使微球呈單層分布，待水自然風(fēng)干后，聚苯乙烯球?qū)①N在載玻片表面．

通過(guò)大步長(zhǎng)粗略掃描可確定掃描的起始位置以及范圍．納米位移臺(tái)移動(dòng)步長(zhǎng)為50nm，光纖光譜儀單點(diǎn)積分時(shí)間為100ms．對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行x-y二維方向掃描，完成步長(zhǎng)為50nm，幅面步數(shù)為50×50，幅面尺寸為2.5μm×2.5μm的二維空間x-y范圍的CARS顯微圖像掃描．圖5(a)為用Matlab軟件重構(gòu)后獲得的直徑為110nm聚苯乙烯微球的CARS圖像，圖5(b)為經(jīng)高斯擬合后的系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，其半高全寬約為484nm．

圖5 110 nm聚苯乙烯微球的x-y平面CARS顯微圖像及高斯擬合后的x-y平面點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)Fig.5 The x-y dimensional CARS microscopic images of the 110 nm polystyrene balls and point spread function of the CARS system in x-y plane via Gaussian fitting

根據(jù)110nm微球的二維顯微圖像，確定該球在x-y空間的中心位置后，進(jìn)行x-z方向的逐點(diǎn)掃描，則可獲得顯微系統(tǒng)的軸向空間分辨率．掃描過(guò)程中，以x軸為快軸，z軸為慢軸，完成二維空間x-z范圍的CARS顯微圖像掃描．圖6(a)為重構(gòu)獲得的110nm聚苯乙烯微球x-z方向的CARS顯微圖像，圖6(b)為經(jīng)高斯擬合后的的系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，其半高全寬約為3.17μm．

圖6 110 nm聚苯乙烯微球的x-z平面CARS顯微圖像及高擬合后的x-z平面點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)Fig.6 The x-z dimensional CARS microscopic images of the 110 nm polystyrene balls and point spread function of the CARS system in x-z plane via Gaussian fitting

本研究搭建的CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率均高于由阿貝衍射極限決定的理論空間分辨率．橫向空間分辨率下降是由于周圍環(huán)境空氣流動(dòng)及光學(xué)平臺(tái)振動(dòng)等原因?qū)е碌膼?ài)里斑漂移，經(jīng)測(cè)試得到成像時(shí)間內(nèi)愛(ài)里斑相對(duì)運(yùn)動(dòng)在x和y方向的標(biāo)準(zhǔn)差分別為σx=94 nm和σy=286 nm．軸向空間分辨率下降則主要是由于泵浦光和斯托克斯光發(fā)散角不同及中心波長(zhǎng)為820 nm的斯托克斯光經(jīng)過(guò)OPO的倍頻晶體后像散嚴(yán)重所致．為提高CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率，可采取以下措施：① 將系統(tǒng)與周圍環(huán)境隔離，更換具有主動(dòng)隔振功能的光學(xué)平臺(tái)，盡量降低愛(ài)里斑的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，提高橫向空間分辨率；② 為提高軸向空間分辨率，測(cè)試并控制兩束激發(fā)光的發(fā)散角，使其盡可能接近，并在飛秒激光脈沖泵浦OPO前先將其分光，一束泵浦OPO，一束直接作為斯托克斯光，不再采用尚未耗盡的820 nm激光脈沖作為斯托克斯光來(lái)降低像散；③ 根據(jù)激發(fā)光波長(zhǎng)定制消色差顯微物鏡，提高CARS顯微成像系統(tǒng)空間分辨率．

結(jié) 語(yǔ)

CARS顯微成像技術(shù)可在無(wú)需標(biāo)記前提下獲取樣品分子某一特征振動(dòng)模式的空間分布信息．通過(guò)逐點(diǎn)掃描的方法獲得成像物體上每一點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)和相應(yīng)的空間位置信息，每一點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)一個(gè)txt文件，將其映射為灰度值，通過(guò)Matlab軟件重構(gòu)獲得樣品的偽彩色圖像．空間分辨率是衡量CARS顯微成像系統(tǒng)性能的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究通過(guò)三維掃描一個(gè)直徑遠(yuǎn)小于入射光波長(zhǎng)的聚苯乙烯微球，得到CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率．結(jié)果表明，CARS顯微成像系統(tǒng)的橫向和軸向空間分辨率均高于由阿貝衍射極限所決定的理論空間分辨率．橫向空間分辨率下降是由于周圍環(huán)境空氣流動(dòng)以及光學(xué)平臺(tái)振動(dòng)等因素導(dǎo)致的愛(ài)里斑漂移，軸向空間分辨率下降主要是由于泵浦光和斯托克斯光發(fā)散角不同，以及斯托克斯的像散所致．以后將針對(duì)以上幾點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，以期提高CARS系統(tǒng)的空間分辨率．

致謝：衷心感謝屈軍樂(lè)教授的悉心指導(dǎo)!

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【中文責(zé)編：英 子；英文責(zé)編：木 南】

2016-12-21；Accepted：2017-02-11

Associate professor Chen Danni．E-mail: dannyc007@163.com

Three-dimensional spatial resolution calibration of the coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy

Liu Wei, Liu Shuanglong, Chen Danni, and Niu Hanben

College of Optoelectronic Engineering, Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

The spatial resolution is one of the most important indices for measuring the performance of coherent anti-stokes Raman scattering (CARS) microscopy system. Accordingly, we acquire the three dimensional images of the polystyrene micro-balls with 110 nm diameter in order to reconstruct the point spread function of the system onx-yandx-zplanesbasedonthetwodimensionalarrayconsistingofpositiondataofeachpointandspectraldata.TheresultsshowthatlateralandaxialspatialresolutionsofthehomemadeCARSmicroscopyareabout484nmand3.17μm,respectively.

optical engineering; coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy；imaging reconstruction; point spread function；resolution; nonlinear optics; Raman scattering; information optics

：Liu Wei, Liu Shuanglong, Chen Danni, et al．Three-dimensional spatial resolution calibration of the coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(3): 272-277.(in Chinese)

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012YQ 15009203)

劉 偉(1980—)，女，深圳大學(xué)博士后研究人員．研究方向：非線性光學(xué)．E-mail：liuwei616029@163.com

Q631；O

A

10.3724/SP.J.1249.2017.03272

Foundation：The Special Funds of the Major Scientific Instruments Equipment Development of China (2012YQ15009203)

引 文：劉 偉，劉雙龍，陳丹妮，等．CARS顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率標(biāo)定[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(3)：272-277.