王娟娟，孔維歡，吳書奇，李蓮瑞*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832000；3.塔里木大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

和田黑雞與普通商品雞體液免疫水平差異分析

王娟娟1,2，孔維歡2，吳書奇3，李蓮瑞3*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832000；3.塔里木大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

利用硫酸銨鹽析法提取免疫球蛋白，采用SDS聚丙烯酰胺法和玫瑰花環(huán)試驗的結(jié)果判定和田黑雞（未注射疫苗）和普通商品雞（注射疫苗）體液免疫水平的差異，并分析疫苗對于家禽免疫力的影響。因和田地區(qū)大部分的和田黑雞都不予以注射疫苗，導(dǎo)致和田黑雞的免疫力和抗病力都較低，極大影響了和田黑雞的商品效益和品種的品質(zhì)，而普通肉用商品雞因出生就開始免疫，免疫力和抵抗力都優(yōu)于和田黑雞，所以本試驗分別提取未注射疫苗的和田黑雞和普通商品雞的外周血，通過密度梯度離心法分離血清，采用鹽析法提取血清中的免疫球蛋白IgG，然后將提取的IgG進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，對比相同濃度下，和田黑雞和普通商品雞IgG的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳輕鏈和重鏈的蛋白量，同時，進行和田黑雞和普通商品雞EAC花環(huán)對比試驗，分析疫苗注射對免疫力影響的高低。通過試驗可以看出普通商品雞IgG的輕鏈和重鏈的蛋白量都顯著大于和田黑雞，并且經(jīng)統(tǒng)計普通商品雞的EAC花環(huán)率為23.42%，和田黑雞的EAC的花環(huán)率為15.3%，運用統(tǒng)計學(xué)對兩個樣本進行差異顯著性檢驗分析，可以看出普通商品雞的EAC花環(huán)率比和田黑雞的EAC花環(huán)率差異顯著(0.01＜P≤0.05)，試驗結(jié)果顯示疫苗注射后的普通商品雞體液免疫水平要遠遠高于和田黑雞，疫苗注射能夠刺激普通商品雞機體主動產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答增強免疫力，預(yù)防疾病，這為和田黑雞疫苗注射的推廣和后期的疫苗研發(fā)提供了必要的參考依據(jù)，通過選擇合適的疫苗并進行免疫，是保證家禽養(yǎng)殖的成功和工作人員人身安全的重要手段。

和田黑雞和普通商品雞；體液免疫；差異分析；

IgG（免疫球蛋白）是一類具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的免疫球蛋白，普遍存在于哺乳動物的血液、組織液及外分泌液中，在動物體內(nèi)具有重要的免疫和生理調(diào)節(jié)作用，是動物體內(nèi)免疫最關(guān)鍵的組成物質(zhì)之一，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗原性差異，免疫球蛋白可分為IgG、IgM、IgA、IgE和IgD[1]，雞的lgG主要存在IgM、IgA和IgG中，其中IgG又稱作IgY，相當(dāng)于哺乳動物的lgG和IgE[2]，IgG主要是從血清和卵黃中提取，而卵黃抗體是由血清抗體(主要是IgG)在卵黃中的積累形成的[3]，IgG是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，單體分子結(jié)構(gòu)都是相似的，為兩條相同的重鏈和輕鏈四條肽鏈構(gòu)成的“Y”字形的分子，重鏈包括可變區(qū)（variable region,VH）和恒定區(qū)（constant region,CH），輕鏈可變區(qū)（VL）與重鏈的可變區(qū)相對應(yīng)，構(gòu)成抗體分子的恒定區(qū)（CL）[4]，紅細胞受體(ER)能與動物的紅細胞結(jié)合形成玫瑰花結(jié)[5]，通過玫瑰花環(huán)抑制試驗[6,7]可以反應(yīng)出和田黑雞和普通商品雞的免疫力的高低，這對動物疫病診治、飼養(yǎng)繁殖以及血液學(xué)特性的深入研究等方面都提供了重要參考依據(jù)[8]，也為和田黑雞的品種資源保種和擴繁提供基礎(chǔ)的參考材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物普通商品雞（圖1）與和田黑雞（圖2）來源：塔里木大學(xué)動科院實驗站（注：和田黑雞未注射疫苗，商品雞已注射疫苗）；豚鼠：養(yǎng)殖場購買。

圖1 普通商品雞

圖2 和田黑雞

1.1.2 試驗試劑磷酸鹽緩沖液、50%硫酸銨溶液、pH8.0的0.005mol/L磷酸緩沖液、奈氏試劑1mmol/L EDTA、30%丙稀酰胺、Tris(pH8.8)、Tris (pH6.8)、10%SDS、10%過硫酸銨、DTT、TEMED、雞紅細胞懸液、補體。

1.1.3 試驗主要儀器雪花制冰機（FM180型北京長流科技儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（OK-S26型上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；高速臺式冷凍離心機（Neofuge15R型力康發(fā)展有限公司）；垂直板狀電泳儀（DYC2-24DIV型北京六一儀器制造廠）；電腦三恒多用電泳儀（DYY―10C型北京六一儀器制造廠）；低速臺式離心機（TDL-5上海安亭科學(xué)儀器廠）；70℃超低溫冰柜(DN-HW328中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；電子天平(BS124S北京市賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；超凈工作臺（SW-CJ-2F型上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；全自動攝影生物顯微鏡（DP70+B10-olysLIA日本奧林巴斯）；電子萬用爐（DL-1型北京永光明醫(yī)療儀器廠）；紫外可見分光光度計（Golds54型上海棱光技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 IgG的分離和純化[11]及蛋白電泳IgG的分離純化：取抗血清2ml加2ml PBS(血清已用Hanks液稀釋一倍），慢慢搖動避免形成泡沫。在冰浴中逐滴加入4ml飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，以防止形成團塊，減少沉淀。此時即有大量的γ-球蛋白沉淀（主要是IgG）[9]，置4℃冰箱靜置30 min冷凍離心(3000rpm，15min)，棄上清。沉淀用2ml PBS緩沖液溶解。逐滴加入1ml飽和硫酸銨邊加邊攪拌，使飽和度為33%，置4℃冰箱30 min，離心收集沉淀（3000rpm，15min），反復(fù)三次，可得到較純的IgG。

1.2.2 IgG的濃度測定提前將儀器打開，待儀器開機與自校成功后，預(yù)熱30min后進行測定工作，調(diào)波長，放置標(biāo)準(zhǔn)液，調(diào)吸光度，將普通商品雞和和田黑雞的原倍IgG樣品加入比色皿中，放入儀器的樣品室內(nèi)，記住放置的順序。蓋下樣品室蓋。依次向外拉出相應(yīng)“1”、“2”位置，讀出相應(yīng)的吸光度值。通過讀數(shù)對比普通商品雞和和田黑雞的IgG的樣品濃度是否一致，如有差異再進行調(diào)整使兩者濃度相等。經(jīng)測定普通商品雞和和田黑雞的OD280值為1.78[10]。

1.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制[5]及電泳按蛋白電泳槽廠商使用指南安裝玻璃平板夾層并固定，確定所需凝膠溶液體積，按表1的數(shù)值配制相應(yīng)濃度的分離膠溶液，并按順序加樣。取蛋白濃度一致的普通商品雞與和田黑雞血清IgG樣品10μl，用PBS倍比稀釋至8倍后，加等體積的1×SDS凝膠加樣緩沖液，5min沸水浴后離心。

將電泳裝置與電源相接（正極應(yīng)接下槽），凝膠上所加電壓為8v/cm。當(dāng)染液前沿進入分離膠后，把電壓提高到15v/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部（約需4h）。

表1 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液

按表2制備積層膠：按表給出的數(shù)據(jù)在離心管中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。加入TEMED后，立即混勻液體并進入下一步操作,配制積層膠所需溶液。

表2 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5%積層膠所用溶液

1.2.4 染色與脫色在45ml甲醇和45ml水（1: 1）和10ml冰乙酸的混合液溶解0.25g考馬斯亮藍R250，用濾紙過濾染液去除顆粒狀物質(zhì)，要用染液完全浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上于室溫染色4h以上，移出并回收染液以備后用，將凝膠浸泡于不加染料的脫色液中，平緩搖動4～8h，其間應(yīng)更換脫色液三四次。脫色越充分，考馬斯亮藍染色法的蛋白質(zhì)檢出下限就越低，脫色24h通常能檢測到單一條帶中含量低至0.1μg的蛋白質(zhì)，脫色后，可將凝膠浸于水中，用于后續(xù)拍照，脫色時要注意控制脫色時間，過長的脫色時間或者過短的脫色時間對結(jié)果都會產(chǎn)生影響。

1.2.5 EAC花環(huán)形成試驗[11]EAC懸液的配制：取4%的CRBC懸液（雞紅細胞懸液）200μl加等量的用無鈣、鎂Harks液稀釋成一定濃度的溶血素混勻，置37℃水浴15min，取出后加入50μl（原倍、10倍、50倍、100倍）稀釋的補體，再放于37℃水浴15min取出，備用。

淋巴細胞的分離：取加1ml無鈣、鎂的Harks液的抗凝血1ml沿管壁輕輕地加入裝入1ml分層液的小試管中，使二者保持清晰的界面，置低速臺式離心機中2000rpm離心20min，取出后吸出富含淋巴細胞層，備用。

取50μl淋巴細胞懸液加50μl EAC懸液混勻，室溫放置30min后，1000rpm離心5min，棄上清，留少許液體，將試管慢慢旋轉(zhuǎn)使細胞懸起，最后再取一滴細胞懸液于載玻片上，慢慢涂開風(fēng)干后進行染色。用100%乙醇滴1～2滴在載玻片上的細胞懸液上，1～2min后。用瑞氏染液染色4min。傾斜沖洗再用工作緩沖液染色4min。傾斜沖洗凈染液后再用吉姆薩工作染液4min后沖洗凈晾干后鏡檢。在高倍鏡下計數(shù)200個淋巴細胞中形成EAC花環(huán)的百分數(shù)，淋巴細胞周圍粘附3個以上CRBC者為EAC花環(huán)形成細胞。觀察時要注意混入的多形核白細胞和單核細胞形成的花環(huán)，不應(yīng)將其計入，可從形態(tài)上加以區(qū)分。

2 試驗結(jié)果

2.1 淋巴細胞分離結(jié)果低速臺式離心機中2000rpm離心20min后，可見清晰的分層，一般分為四層，分別為血漿層、淋巴細胞層、分離液層和紅細胞層。從圖3、圖4我們可以明顯的看出，未注射疫苗的和田黑雞分離出的淋巴細胞的量要明顯少于注射疫苗的普通商品雞，在機體體液免疫和細胞免疫等特異免疫反應(yīng)中，淋巴細胞起著重要作用，淋巴回流使淋巴結(jié)能很快地接受侵入機體的抗原刺激，經(jīng)過一系列復(fù)雜的細胞和體液因子的作用，發(fā)動了對此抗原特異性的免疫反應(yīng)，通過輸出效應(yīng)淋巴細胞或免疫活性成分，發(fā)動身體其他部位，特別是有害成分侵入?yún)^(qū)域的免疫反應(yīng)，及時解除對機體的傷害，未進行疫苗免疫的和田黑雞的淋巴細胞的數(shù)量明顯少于疫苗注射的普通商品雞，反映出了疫苗注射對于提高禽類的免疫能力具有重要的作用。

圖3 和田黑雞淋巴細胞分離圖

圖4 普通商品雞淋巴細胞分離圖

2.2 EAC花環(huán)試驗的結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 和田黑雞EAC花環(huán)

圖6 普通商品雞EAC花環(huán)

經(jīng)統(tǒng)計和田黑雞的EAC花環(huán)率為15.3%，普通商品雞的EAC花環(huán)率為23.42%（健康動物的EAC花環(huán)率正常值為15%～30%），通過兩個樣本百分數(shù)差異顯著性檢驗的統(tǒng)計學(xué)分析表明，普通商品雞的EAC花環(huán)率與和田黑雞的EAC花環(huán)率差異顯著(0.01〈P≤0.05)[12]。說明普通商品雞的B淋巴細胞數(shù)目比和田黑雞多?；ōh(huán)統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 和田黑雞與普通商品雞EAC花環(huán)統(tǒng)計結(jié)果

2.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠的電泳結(jié)果見圖7、圖8。

IgG是血清主要的抗體成分，約占血液中IG總量的70%～75%，在結(jié)合補體、增強免疫細胞、吞噬病原微生物和中和細菌毒素的能力方面具有重要作用，能有效地抗感染。重鏈又稱H鏈，大約由420～440個氨基酸組成，分子量約為50000～77000。輕鏈又稱L鏈，由213～214個氨基酸組成，分子量約為22500。從圖7、圖8看出，普通商品雞和和田黑雞跑出兩條清晰的條帶。一條帶在67～70KD之間，另一條帶在25～29.0KD之間[13]，正好符合IgG的重鏈帶和輕鏈帶的分子量，IgG是動物血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白含量的75%～80%，IgG也是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，尤其是在機體的免疫反應(yīng)中，IgG的含量最高，是體液免疫的主力軍[14]。

圖7 普通商品雞IgG電泳(10mL血漿分離純化)

圖7中原倍代表1倍稀釋，即為PBS和分離純化血漿以1:1比例進行稀釋，以此類推，是將上一次稀釋后的血漿再按1:1比例進行再次稀釋，× 4、×8、×16分別代表4倍稀釋、8倍稀釋和16倍稀釋，通過SDS聚丙烯凝膠電泳，我們可以從圖7上看到清晰的兩條帶，分別為重鏈和輕鏈，重鏈的分子量大小為67～70KD，而輕鏈的分子量大小為26～28KD,由于普通商品雞的IgG含量較大，濃度較高，所以重鏈與輕鏈的條帶較寬且顏色較深，這說明普通商品雞具有較高的免疫力。

圖8 和田黑雞IgG電泳結(jié)果(10ml血漿分離純化)

從圖8得知，與普通商品雞一樣，和田黑雞IgG電泳結(jié)果同樣都具有重鏈和輕鏈，但其帶寬要遠遠小于普通商品雞的，且顏色較暗。通過圖7、圖8對比，可以看出普通商品雞IgG的含量要遠大于和田黑雞，這反映出了普通商品雞具有更強的免疫力。

5ml普通商品雞血漿分離純化得到的IgG凝膠電泳所得的結(jié)果見圖9。

圖9 普通商品雞與和田黑雞的IgG電泳（5ml）

從圖9可以看出普通商品雞的IgG含量依然很高，但和田黑雞的IgG含量較低，輕鏈基本看不到條帶，說明隨著稀釋度的遞增兩種雞IgG含量都遞減,并且普通商品雞IgG的濃度要比和田黑雞大，經(jīng)實驗摸索15ml和田黑雞分離純化后的血漿中IgG含量與5ml普通商品雞分離純化的血漿中IgG的含量相當(dāng)，電泳結(jié)果見圖10。

圖10 普通商品雞（5ml）和田黑雞IgG電泳（15ml）

從圖10可以看出，3倍的和田黑雞血漿所提取的IgG含量與普通商品雞的IgG含量大致相當(dāng)，說明，普通商品雞比和田黑雞有更強的免疫能力，這反映出了疫苗注射對于商品雞的免疫能力起到了很大的提高作用。

3 討論

從未注射疫苗的和田黑雞與注射疫苗的普通商品雞在淋巴細胞分離、玫瑰花環(huán)及IgG聚丙烯凝膠電泳的結(jié)果都顯示了疫苗免疫后的普通商品雞比和田黑雞具有更強的免疫力[15,16,17]，疫苗注射對于提高家禽的免疫力具有顯著的作用。

Barrington[18]認為，對新生幼畜而言，成功的被動免疫就是適量、及時地攝取和吸收IgG，而中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所的劉先菊、楊帆等人就專門研究了虎血清免疫球蛋白的純化及活性鑒定的研究，并建立了一種簡單快速的分離純化虎血清的方位，為虎血清的IgG二級抗體的制備提供了高純度、活性好的抗體疫原[19]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒(HCV)與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)同為黃病毒科、瘟病毒屬成員，兩者在基因結(jié)構(gòu)和抗原性上有很高的同源性，具有共同的可溶性抗原，因此，可以產(chǎn)生交叉免疫保護作用，馮彥軍等[20]、劉亞剛等[21]長期、多次的實驗證明了用豬瘟弱毒苗預(yù)防牛病毒性腹瀉黏膜病是安全有效的，所以，選擇豬瘟弱毒苗來免疫犢奶牛具有顯著效果，這都給我們在以后的飼養(yǎng)家禽過程中通過合理的飼喂管理和通過免疫注射的方法提高家禽的免疫力提供了重要的參考依據(jù)。國外的許多學(xué)者證明了免疫增強物質(zhì)對提高動物體免疫力的重要性，在以后的研究過程中，要加強疫苗與免疫增強劑的研究，以促進我國家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康穩(wěn)定的發(fā)展，在滿足人們對健康飲食的要求的同時，實現(xiàn)家禽市場的可持續(xù)發(fā)展和經(jīng)濟效益的最大化。

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S858.312.4

B

1673-1085（2017）06-0008-07和田黑雞（尼雅型）是民豐縣一種古老、珍貴和獨特的地方家禽品種，也是新疆高寒地區(qū)農(nóng)牧民養(yǎng)殖的主體家禽，肉質(zhì)極佳，鮮嫩可口，隨著其市場價值的遞增，對和田黑雞所進行的研究也越來越多，具有抗逆抗病性強、耐粗飼、抗高溫、遺傳性穩(wěn)定、飼料報酬高、經(jīng)濟利用價值高的特點，且一年四季均有就巢性，并未與其他雞種雜交，具有原始生態(tài)條件和品種的特殊性能，具有較高的綠色價值，是非常珍貴的保健食品之一，并且是優(yōu)良的肉蛋兼用型地方品種,但和田地區(qū)大部分的養(yǎng)殖戶因其實用價值，都未對其進行疫苗注射，并且極為反對對和田黑雞進行疫苗免疫，這就造成了和田黑雞普遍免疫力低下、抗病力差、死亡率高的現(xiàn)象，極大地影響了和田黑雞的商品價值及市場經(jīng)濟效益，對和田黑雞的大規(guī)模和持續(xù)性養(yǎng)殖也產(chǎn)生了極大的阻礙作用。目前關(guān)于和田黑雞的研究資料甚少，尤其是關(guān)于疫苗免疫對于和田黑雞免疫力影響研究的文章甚少，本文旨在通過對未注射疫苗的和田黑雞和注射疫苗的商品雞的免疫效果進行對照，為和田黑雞疫苗免疫的推廣提供切實可靠的參考依據(jù)。

2017-05-06

王娟娟（1986-），女，漢族，新疆吐魯番人，現(xiàn)學(xué)在讀博士，專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖，郵箱：wangjuanjuand10@163.com。

*通訊作者：李蓮瑞（1968-），女，漢族，教授，博士，新疆庫爾勒人,研究方向：動物基因工程，電子郵箱：lilianrui51@163.com。