韓聰孫保存趙秀蘭張艷輝古強劉芳趙楠吳麗麗

·基礎(chǔ)研究·

p-STAT3通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移性研究*

韓聰①孫保存①②③趙秀蘭①③張艷輝②古強①③劉芳①趙楠①吳麗麗③

目的：研究p-STAT3的活化在結(jié)腸癌中的表達與Snail、MMP2的相關(guān)性，及其在離體細胞實驗中激活受抑后對結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響并探討其機制。方法：免疫組織化學染色檢測p-STAT3與Snail、MMP2的表達及其相關(guān)性，分析三者與TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度之間的關(guān)系；MTT實驗篩選AG490對增殖無影響的濃度和時間，并用該濃度和時間進行后續(xù)實驗；采用Western blot法檢測AG490抑制p-STAT3活化后STAT3、Snail、MMP2蛋白表達情況；劃痕實驗觀察p-STAT3活化受抑后，結(jié)腸癌細胞遷移情況。結(jié)果：免疫組織化學染色結(jié)果表明，p-STAT3的表達與Snail、MMP2均存在相關(guān)性，且均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。在兩個結(jié)腸癌細胞系中，通過MTT實驗，選出10μM作為AG490的最佳作用濃度，并采用該濃度進行后續(xù)實驗。AG490抑制p-STAT3活化后Snail、MMP2表達明顯下降，而STAT3總蛋白表達無明顯變化。且當AG490抑制p-STAT3活化后，細胞的遷移能力明顯下降。結(jié)論：p-STAT3可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。

結(jié)腸癌 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 p-STAT3 Snai l MMP2 AG490

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重危害人類生命健康，腫瘤的快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。目前較為公認的調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子主要包括Snail［1］、ZEB1［2］、Twist［3］等，近年來研究發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activatorof transcription 3，STAT3）信號的異常激活也與腫瘤的EMT相關(guān)［4］。EMT的發(fā)生需要降解細胞外基質(zhì)，金屬基質(zhì)蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵成員［5］。本研究采用免疫組織化學染色法檢測結(jié)腸癌組織中p-STAT3與Snail及MMP家族重要成員MMP2蛋白的表達和相關(guān)性，分析三者與TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度的關(guān)系，并利用細胞學實驗進一步闡述阻斷p-STAT3活化抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本選取2002年3月至2005年12月于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院行手術(shù)切除，病理診斷為結(jié)腸癌且隨訪資料完整的患者組織標本65例。其中男性28例，女性37例，年齡為28～83歲；Dukes分期A/ B期26例，C/D期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；遠處轉(zhuǎn)移37例，無遠處轉(zhuǎn)移28例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期25例，Ⅲ/Ⅳ期40例；高分化18例，中分化27例，低分化20例。所有病例均為手術(shù)標本且患者未接受放、化療。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核通過，并經(jīng)全部患者及其家屬知情同意。

1.1.2 細胞系人結(jié)腸癌細胞株HCT116、HT29細胞系購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞資源中心。

1.1.3 實驗試劑IMDM（ISCOVE'smodified DMEM）、DMEM/F12（Dulbecco'smodified Eagle'smedium：nutrient mixture F-12）培養(yǎng)基及MTT試劑盒均購自南京凱基生物公司，胎牛血清FBS購自美國Gibco公司。AG490購自美國Selleck公司。兔抗人p-STAT3（Tyr705）抗體購自美國CST公司，鼠抗人STAT3抗體購自美國SantaCruz公司；兔抗人Snail抗體購自美國Abcam公司，兔抗人MMP2抗體購自美國ProteintechTM公司。兔抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色結(jié)腸癌組織石蠟標本連續(xù)切片脫蠟水化，使用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)，于室溫下血清封閉，一抗置于4℃冰箱過夜，次日常溫下孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，中性樹膠封片。陰性對照一抗用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）代替。采用Mattern積分法［6］判斷染色結(jié)果，陽性細胞百分率：每例標本隨機選取10個代表性的高倍視野（×400）分別計數(shù)100個腫瘤細胞的平均值，＜10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～100%為3分。染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分率得分和染色強度得分相加，結(jié)果＞3為陽性，≤3為陰性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)本實驗中所有細胞均按照常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)模式進行培養(yǎng)，HCT116細胞系培養(yǎng)基為90%IMDM+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），HT29細胞系培養(yǎng)基為95%DMEM-F12+5%胎牛血清+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2、恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合約80%時，胰酶消化傳代以保持細胞增殖活力。

1.2.3 MTT實驗MTT法檢測AG490對HCT116、HT29細胞生長的影響。常規(guī)培養(yǎng)HCT116、HT29細胞進入對數(shù)期后，配制成5×104/mL的細胞懸液，取3塊96孔板，每孔加入100μL細胞懸液，實驗組分別加入終濃度為10、20、30、40、50μM的AG490培養(yǎng)液，各組溶液中二甲基亞砜（DMSO）體積分數(shù)不超過0.1%；對照組加入等量DMSO溶液，空白對照組僅加入完全培養(yǎng)基，不加細胞懸液。實驗組和對照組均設(shè)5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h后，分別加入MTT 50μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)液體，加入150μLDMSO，置于搖床上低速振蕩5min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀490 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值。實驗組：HCT116和HT29細胞分別用AG490處理（HCT116-AG490組、HT29-AG490組）；對照組：HCT116和HT29細胞加等量的DMSO處理（HCT116組、HT29組）。選出不影響細胞增殖的最適濃度及最佳作用時間進行后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot檢測細胞裂解液RIPA-SDS裂解細胞，提取細胞總蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠80 V恒壓電泳2 h，之后250mA恒流1.5 h將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜；次日室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，發(fā)光液A和B以1:1比例混勻后顯影。用Image-J測量每個條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 劃痕實驗將對數(shù)增長期的HCT116、HT29細胞接種于六孔板，貼壁后，實驗組給予10μM AG490處理，對照組加等量的DMSO，作用48 h后，用100μL移液槍頭在各孔中央細胞表面垂直劃痕，PBS沖洗脫落的細胞，顯微鏡下拍照記為0，此后24、48 h分別拍照。觀察細胞遷移變化情況并測量遷移距離，計算遷移率。

1.2.6 細胞形態(tài)觀察AG490作用細胞48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并比較對照組和實驗組細胞形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩因素之間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，不同時間點兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p-STAT3、Snail、MMP2在結(jié)腸癌中的表達及其與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和分化程度的關(guān)系

p-STAT3的陽性染色主要表達于癌細胞核，少量表達于胞漿，而癌組織間質(zhì)呈現(xiàn)陰性，Snail的陽性染色主要定位于癌細胞核，MMP2的陽性染色主要定位于癌細胞胞漿（圖1）。p-STAT3、Snail、MMP2的陽性表達率分別是61.5%、56.9%、53.8%。在65例結(jié)腸癌組織中，p-STAT3表達與Snail、MMP2表達存在顯著相關(guān)性（表1），且p-STAT3、Snail、MMP2與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移均存在顯著相關(guān)性，而與腫瘤的分化程度均無相關(guān)（表2）。

圖1 p-STAT3、Snail、MMP2在結(jié)腸癌組織中的陽性和陰性表達（IHC×200）Figure 1 Positive and negative expression ofp-STAT3,Snail,and MMP2 in colorectalcancer tissues(IHC×200)

表1 p-STAT3與Snai l、MMP2的相關(guān)性（n=65）Table 1 Correlation among p-STAT3 and SnailaswellasMMP2(n=65)

2.2 不同濃度的AG490對兩種結(jié)直腸癌細胞增殖的抑制作用

MTT實驗結(jié)果顯示，AG490對HCT116細胞、HT29細胞均具有抑制增殖的作用，且隨AG490的濃度增大和作用時間的延長，抑制作用增強。10μM AG490處理24、48 h對細胞生長的抑制作用與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。且48 h的作用時間更長，故選擇10μM的AG490作為后續(xù)實驗的最適濃度，48 h為最佳作用時間（圖2）。

2.3 AG490對HCT116、HT29細胞p-STAT3、STAT3、Snail、MMP-2蛋白表達的影響

AG490處理HCT116、HT29細胞后，與對照組相比p-STAT3、Snail及MMP-2蛋白表達量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與STAT3蛋白表達量的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖3）。

2.4 AG490對HCT116、HT29細胞遷移能力的影響

劃痕實驗可以用于評價AG490對HCT116細胞和HT29細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，HCT116-AG490實驗組遷移率明顯低于HCT116組，HT29-AG490實驗組遷移率明顯低于HT29組，實驗組遷移能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 AG490對結(jié)腸癌細胞形態(tài)的影響

與對照組相比，加入AG490的HCT116細胞和HT29細胞，細胞形態(tài)均發(fā)生了不同程度縮短、變粗（圖5）。

表2 p-STAT3、Snai l、MMP2與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及分化程度的相關(guān)性（n=65）Table 2 Correlation ofp-STAT3,Snailand MMP2w ith TNM stage,lymph nodemetastasis,distantmetastasis,and differentiation(n=65)

圖2 各濃度AG490對結(jié)腸癌細胞的生長抑制作用Figure 2 Effectsofdifferent AG490 concentrationson colorectalcancer celllines

圖3 Western blot檢測AG490作用的結(jié)腸癌細胞p-STAT3，STAT3，Snail，MMP2的表達變化Figure 3 Changes in the protein expression ofp-STAT3,STAT3,Snail,and MMP2 in colorectalcancer cellsafter AG490 treatment

圖4 AG490抑制p-STAT3活化對結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響Figure 4 Effects of AG490 treatment on the m igration capacity of colorectalcell lines

?圖5 HCT116、HCT116-AG490、HT29、HT29-AG490細胞形態(tài)學變化（鏡像×400）Figure 5 Significant changes in HCT116-control, HCT116-AG490,HT29-control,and HT29-AG490 cells (image×400)

3 討論

結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第3位和第5位，并呈上升趨勢［7］，嚴重威脅人類生命健康。其高發(fā)病率和死亡率給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。

JAK/STAT信號途徑廣泛參與人體生理和病理活動，是一條重要的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其在乳腺癌［8］、胃癌［9］、皮膚癌［10］等多種腫瘤中存在異常活化狀態(tài)。有研究表明，STAT3組成型活化即p-STAT3的異?；罨c腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。并且JAK/ STAT信號通路的異?；罨軌蛘{(diào)節(jié)多種腫瘤的增殖、凋亡［12］和血管生成［13］及血管生成擬態(tài)形成［9］等多種生物學行為。有研究表明，在結(jié)腸癌中也存在著p-STAT3的異?；罨?，并且可能通過影響HIF-1α的轉(zhuǎn)錄來影響結(jié)腸癌的發(fā)生［14］。本研究的免疫組織化學實驗結(jié)果也同樣證明，p-STAT3在結(jié)腸癌中存在高表達的現(xiàn)象，且p-STAT3與轉(zhuǎn)錄因子Snail、金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2的表達存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。并且三者均和結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠外轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

EMT是惡性腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的一種重要方式，是指上皮來源的腫瘤細胞上皮樣表型向間質(zhì)樣細胞表型轉(zhuǎn)變，其重要一環(huán)是細胞外基質(zhì)的降解，而MMP2是導(dǎo)致基質(zhì)降解，腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的一項重要因素［15］。Snail是最早發(fā)現(xiàn)的EMT轉(zhuǎn)錄因子，它的異常高表達可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進腫瘤的遷移侵襲［1］。

AG490作為一種JAK激酶競爭性抑制劑，可以有效地抑制STAT3活化［16］。有研究表明，AG490能夠抑制肝癌細胞STAT3的活化和Snail的表達來抑制其侵襲轉(zhuǎn)移［17］。在胰腺癌中也有相似的發(fā)現(xiàn)，AG490可以抑制胰腺癌細胞的STAT3活化和VEGF表達來抑制其侵襲轉(zhuǎn)移［18］。本研究的Western blot檢測結(jié)果也有相似的發(fā)現(xiàn)，AG490作用于結(jié)腸癌細胞HCT116和HT29細胞系時，p-STAT3活化減少，Snail和MMP2的表達下降，通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)細胞的遷移能力下降。同時通過觀察細胞形態(tài)，AG490使細胞縮短、變粗，抑制了EMT。Western blot檢測、劃痕實驗及細胞形態(tài)學觀察結(jié)果說明AG490可以抑制p-STAT3活化，并通過降低Snail和MMP2的表達來抑制結(jié)腸癌的侵襲遷移。

本研究表明，p-STAT3與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在結(jié)腸癌組織和離體細胞培養(yǎng)Western blot檢測均發(fā)現(xiàn)p-STAT3的活化與Snail和MMP2表達有關(guān)。P-STAT3的過度激活可能通過影響Snail和MMP2的表達，誘導(dǎo)EMT發(fā)生，進而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。抑制p-STAT3的過度激活可能為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的思路和啟示。

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（2017-01-23收稿）

（2017-05-10修回）

（編輯：武斌校對：孫喜佳）

p-STAT3 promotes colorectal cancer metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition

Cong HAN1,Baocun SUN1,2,3,Xiulan ZHAO1,3,YanhuiZHANG2,Qiang GU1,3,Fang LIU1,Nan ZHAO1,Lili WU3
1Departmentof Pathology,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300070,China;2Departmentof Pathology,NationalClinicalResearch Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's ClinicalResearch Center for Cancer;Tianjin 300060, China;3Departmentof Pathology,Tianjin Medical University GeneralHospital,Tianjin 300052,China

Baocun Sun;E-mail:sunbaocun@aliyun.com

Objective:To determ ine p-STAT3 expression in 65 casesof colorectalcancerand its correlationw ith Snailand MMP2 and to explore themechanism ofp-STAT3 activation in colorectalcancer cellsby inhibiting itsactivation in vitro.Methods:Immunohistochemical techniquewasadopted to exam ine the expression levelsof p-STAT3,Snail,and MMP2.MTTassaywasused to explore the effects of diluting AG490,which doesnotaffect cellproliferation.Western blotwasused to exam ine the expression levelsof p-STAT3,STAT3, Snail,and MMP2.Wound healing assaywasemployed to evaluate them igration of colorectalcancer cells.Results:p-STAT3 expression was significantly correlated w ith Snail and MMP2 expression.Moreover,p-STAT3 expression was significantly correlated w ith TNM stage,lymph nodemetastasis,and distantmetastasis in colorectal cancer tissues(P＜0.05)but not w ith tumor differentiation.Treatmentw ith 10μM AG490 for 48 h did not significantly affect cellproliferation in the controland experimentalgroups(P＞0.05).STAT3 expression wasnot significantly changed when p-STAT3 expression was inhibited by AG490.Meanwhile,the expression levelsof Snail and MMP2 were down-regulated,and them igration ability of colorectal cancer cellswas significantly reduced.Conclusion:p-STAT3 promotescolorectalcancermetastasisby regulating the processofepithelial-mesenchymaltransition.

colorectalcancer,epithelial-mesenchymaltransition,p-STAT3,Snail,MMP2,AG490

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.10.079

①天津醫(yī)科大學病理學教研室（天津市300070）；②天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科；③天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科

*本文課題受國家自然科學基金面上項目（編號：81572872）和國家自然科學基金重點項目（編號：81230050）資助

孫保存sunbaocun@aliyun.com

This work was supported by the NationalNaturalScience Foundation ofChina(No.81572872)and the Key Projectof the NationalNaturalScience Foundation ofChina(No.81230050)

韓聰專業(yè)方向為腫瘤病理學。

E-mail：13516296540@163.com