汪 淼，李 張，孫 群*

（四川大學生命科學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064）

PCR-DGGE分析資中冬尖發(fā)酵過程中細菌多樣性

汪 淼，李 張，孫 群*

（四川大學生命科學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064）

目的：采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術分析資中冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構及其動態(tài)變化。方法：從資中采集4 份不同發(fā)酵年份冬尖樣品，提取樣品總DNA，采用巢式PCR法擴增細菌16S rDNA V3區(qū)，擴增產(chǎn)物采用DGGE分離，對細菌主要優(yōu)勢條帶進行克隆、測序、構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果：冬尖在發(fā)酵過程中細菌多樣性較豐富，且群落結構發(fā)生了較大變化。不同發(fā)酵時間樣品間，細菌群落結構相似性為9%～67%，其中第2年與第3年樣品相似性最高，達67%。資中冬尖發(fā)酵過程中，所涉及的細菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和非培養(yǎng)菌，其中厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，占53%；變形桿菌門占37%；非培養(yǎng)菌僅占10%。結論：采用PCR-DGGE技術能更全面、更真實地反映資中冬尖在發(fā)酵過程中微生物群落的多樣性及其動態(tài)變化，為冬尖的生產(chǎn)工藝和風味物質(zhì)的形成提供理論支撐。

冬尖；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳；細菌多樣性

冬菜是我國傳統(tǒng)的蔬菜腌制品，在國內(nèi)外都頗有盛名，根據(jù)地域與加工方法的不同，主要分為川冬菜、京冬菜、津冬菜和上海五香冬菜等，其中四川冬菜主要以資中冬尖和南充冬菜最為著名[1]。資中冬尖選用薺菜為原料，其生產(chǎn)工藝特征是采用風脫水生產(chǎn)法，即先在風中晾曬，使之脫水，然后再進行鹽漬，采用此加工方法可以減少蔬菜中所含可溶性物質(zhì)的流出。資中冬尖發(fā)酵周期較長，一般1～4 a，隨著發(fā)酵時間的延長，其風味及香氣越濃郁，質(zhì)量越好。成品冬尖呈褐黑色，味鮮細嫩，咸淡適口，回味帶甜，深受消費者喜愛[2-4]。

冬尖發(fā)酵過程中，微生物群落結構的變化以及菌群間的相互作用對冬尖風味的形成起著重要作用，目前對冬尖的研究主要集中在其加工工藝、病害防治、鹵水發(fā)酵、副產(chǎn)物等方面[5-7]，而對冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構的變化研究甚少。早在1995年，萬波等[8]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對資中冬尖發(fā)酵工藝中的微生物學問題進行了研究，對冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構變化有了初步了解，但由于采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，嚴重降低了樣品的微生物多樣性，不能準確、全面地描繪發(fā)酵過程中微生物的概貌，且在此次研究中，分離培養(yǎng)出的微生物僅歸納到類，并未鑒定到種，因此有必要對資中冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構的變化做進一步研究。2012年，董玲等[9]采用16S rDNA-RFLP方法對腌制4 a的南充冬菜進行了細菌群落組成及多樣性分析，但并未對發(fā)酵過程中微生物群落結構的變化進行研究。

1993年，Muyzer等[10]首次將聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）引入微生物生態(tài)領域，該技術可通過免培養(yǎng)法再現(xiàn)原始群落結構，避免分離培養(yǎng)法造成的分析誤差[11-12]，目前該技術已成為研究微生物遺傳多樣性、種群結構和菌群差異的一種先進手段，被廣泛應用于食品領域，如監(jiān)測食品中微生物在時間或空間上的動態(tài)變化[13-15]、鑒定功能微生物和病原菌[16-18]、評價和控制食品質(zhì)量[19-20]等。近年來，國內(nèi)外許多學者采用PCRDGGE技術對腌制蔬菜中的微生物多樣性進行研究，但主要涉及酸菜[21]、泡菜[22-23]、榨菜[24-25]、芽菜[26]、韓國泡菜[27-29]、麻竹筍[30]等，對冬尖的研究鮮見報道。本研究以不同發(fā)酵周期的資中冬尖為對象，采用PCR-DGGE技術，分析冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構及其動態(tài)變化，為冬尖的生產(chǎn)工藝和風味物質(zhì)的形成提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵0（入池之前冬尖）、1、2、3 a的冬尖樣品，由匯源集團資中佳釀食品廠提供。

PCR master mix、PMD19-T Vector 日本Takara公司；去離子甲酰胺 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；四甲基二乙胺、雙丙烯酰胺 美國Sigma公司；過硫酸銨 生工生物工程股份有限公司；凝膠回收試劑盒美國O m e g a公司；D H5 α感受態(tài)細胞、蛋白酶K（proteinase K，PK） 天根生化科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）成都貝斯特試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、溴化十六烷基三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、變性梯度凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 總DNA提取

[31-32]，在無菌條件下，將樣品剪碎后加入20 μL TENP緩沖液，180 r/min搖床20 min。取1 mL樣液加入EP管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液收集菌體，此步驟重復3 次；向菌體中加入1 mL PBS液，吹打均勻，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，此步驟重復2 次；向EP管中加入少量小玻珠和適量石英砂，然后加入1 mL DNA提取液（100 mmol/L Tris、100 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、3% PVP，pH 9.0），旋渦振蕩2 min，吹散菌團，再加入20 μL溶菌酶溶液充分混勻，37 ℃水浴30 min；向EP管中加入100 μL SDS和10 μL PK混勻，先37 ℃水浴30 min，再65 ℃水浴30 min，6 000 r/min離心15 min，收集上清液轉入新EP管；向上清液中加入100 μL5 mol/L NaCl和80 μL CTAB-NaCl混勻，65 ℃水浴10 min，再加入780 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混勻，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，轉上清液入新EP管；向EP管中加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混勻，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，取上清液轉入新EP管中，再加入0.6 倍體積的異丙醇混勻，－20 ℃條件下靜置1 h；EP管中加入500 μL 70%乙醇洗滌，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫干燥10 min，加入50 μL 1×TE buffer，－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增

采用巢式PCR與降落PCR相結合進行擴增，引物見表1。

表1 PCR擴增引物Table1 PCR primers applied in this study

1.3.2.1 第1輪PCR擴增

以總DNA為模板，采用引物27f和1492r對細菌16S rDNA進行擴增。反應體系：上下游引物各0.5 μL，PCR master mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，滅菌ddH2O補足至25 μL。反應程序采用降落PCR模式：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，每個循環(huán)退火溫度依次降低0.5 ℃，72 ℃延伸2 min，20 個循環(huán)；當退火溫度降至55 ℃，再以該溫度擴增10 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。

1.3.2.2 第2輪PCR擴增

以稀釋100 倍的16S rDNA擴增產(chǎn)物為模板，采用引物GC357f和517r[23,33]對細菌16S rDNA V3區(qū)進行擴增。反應體系：上下游引物各1 μL、PCR master mix 25 μL、DNA模板2 μL、滅菌ddH2O補足至50 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。

1.3.3 DGGE及條帶測序

每個樣品取35 μL PCR產(chǎn)物與7 μL 6×loading buffer混勻后加入到點樣孔中。采用8%聚丙烯酰胺變性凝膠，變性梯度為45%～65%。在1×TAE緩沖液中，PCR產(chǎn)物在恒溫60 ℃、恒壓60 V條件下電泳12 h。電泳結束后取出膠放入SYBR GreenⅠ染液中浸染30 min，使用凝膠成像儀拍照。DGGE圖譜中條帶的亮度在一定程度上能反映菌種的數(shù)量，較亮的條帶即為樣品中的優(yōu)勢菌群，對圖譜中較亮的條帶進行切膠，條帶回收，回收的條帶進行一次無GC夾板的PCR擴增，擴增子載入PMD19-T中進行克隆，陽性克隆子菌液送美吉生物公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將DGGE圖譜用Quantity One軟件進行處理，分析各樣品條帶的灰度值、數(shù)量及遷移率，對各樣品相似性采用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法進行聚類分析，同時根據(jù)香龍-威納多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（D）和均勻度指數(shù)（EH）評價各樣品的多樣性[34]，分別根據(jù)公式（1）～（3）計算：

式中：Pi為第i條條帶的灰度值占樣品總灰度值的比值；S為每一泳道中的總條帶數(shù)；N為條帶總數(shù)。

測序結果采用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件，Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（Bootstrap）為1 000。

2 結果與分析

2.1 巢式PCR擴增結果

圖1 細菌巢式PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis profiles of bacterial nested PCR products

由圖1A可知，第1輪PCR對細菌16S rDNA進行擴增，目的產(chǎn)物大小約1.6 kb，所有樣品擴增條帶均與目的條帶一致，可用于后續(xù)實驗。由圖1B可知，第2輪PCR對細菌16S rDNA V3區(qū)進行擴增，目的產(chǎn)物大小約230 bp，所有樣品擴增條帶均與目的條帶一致，可用于DGGE分析。

2.2 細菌DGGE指紋圖譜

DGGE圖譜中條帶的多少能直接反映樣品中微生物的多樣性，條帶的亮度在一定程度上能反映菌種數(shù)量的多少[35]。從圖2可知，不同年份冬尖樣品電泳后分離出的條帶數(shù)目、遷移率及亮度均存在差異，說明冬尖在發(fā)酵過程中細菌群落結構發(fā)生了改變。從DGGE圖譜可以很直觀地看出發(fā)酵1 a的冬尖樣品其電泳條帶數(shù)目最多，豐度最大，而發(fā)酵2 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目相對較少。多樣性指數(shù)是研究群落物種和個體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標[34]，為了更準確地比較不同樣品的多樣性情況，根據(jù)1.4節(jié)計算各樣品的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)。第1年冬尖樣品其多樣性指數(shù)和豐度最高，分別為2.540和1.675，而第2年冬尖樣品其多樣性指數(shù)和豐度最低，分別為1.450和0.829，這個結果與DGGE圖譜直接觀測結果相一致。

圖2 冬尖發(fā)酵各階段細菌DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of bacterial community in Dongjian at different fermentation stages

2.3 DGGE指紋圖譜聚類分析

在DGGE指紋圖譜中，不同樣品共有條帶數(shù)目的多少可以反映樣品間微生物群落結構的相似性，一般采用UPGMA對樣品間微生物群落結構的相似性進行評估。資中冬尖0～3 a樣品的細菌聚類分析結果見圖3。從圖3可知，各樣品間的相似性在9%～67%，說明冬尖在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，細菌群落結構發(fā)生了較大變化。其中第2年和第3年冬尖樣品的相似性最高，為67%，而第1年與第2、3年冬尖的相似性最低，分別只有9%和17%。這可能是因為冬尖在發(fā)酵過程中，第1年為好氧向厭氧轉變的階段，此時大部分微生物還能生長繁殖，因此第1年冬尖樣品中微生物群落結構最豐富，從DGGE指紋圖譜中也能看出其條帶數(shù)目最多。當發(fā)酵繼續(xù)進行到第2、3年時，已完全轉變?yōu)閰捬醐h(huán)境，且營養(yǎng)物質(zhì)也被大量消耗，使大部分微生物生長繁殖受到抑制，只有一部分適應此環(huán)境的特定菌群能很好的生長，從而使第2年和第3年冬尖樣品中微生物菌群結構具有一定趨向性，這也解釋了為什么第2、3年樣品中微生物菌群結構相似性最高。

圖3 冬尖細菌DGGE指紋圖譜聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DGGE profiles for bacterial communities of Dongjian

2.4 DGGE條帶測序及同源性分析

表2 細菌DGGE條帶測序結果Table2 Sequencing results from the bands excised from the bacterial DGGE gels

圖4 冬尖細菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of bacterial species in Dongjian

將細菌DGGE圖譜上較亮的代表條帶，共19 條進行切膠、克隆、測序，并構建進化樹，測序結果見表2，進化樹圖譜見圖4。由表2結果顯示，所有序列與數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列的相似性在97%～100%之間，說明均具有鑒定意義。從細菌N-J進化圖可以看出，資中冬尖在發(fā)酵過程中，所涉及的細菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和非培養(yǎng)菌。其中厚壁菌門細菌類群為優(yōu)勢菌，占53%；其次是變形桿菌門，占37%；最少的為非培養(yǎng)菌，占10%。

3 討論與結論

資中冬尖是以芥菜為原料采用自然發(fā)酵制成的蔬菜腌制品，其風味的形成受眾多因素影響，如原料、工藝、發(fā)酵時間、溫度等，其中發(fā)酵過程中微生物的菌群變化與代謝活動是影響冬尖風味的重要因素。目前關于資中冬尖發(fā)酵過程中微生物多樣性的研究較少，本研究以不同發(fā)酵周期的資中冬尖為對象，采用PCR-DGGE技術，對冬尖發(fā)酵過程中微生物群落結構及其動態(tài)變化進行分析。

結果表明，不同年份的冬尖樣品其電泳后分離出的條帶數(shù)目、遷移率及亮度均存在差異，說明冬尖在發(fā)酵過程中細菌群落結構發(fā)生改變，且發(fā)酵1 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目最多，細菌多樣性較豐富，而發(fā)酵2 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目相對較少。對DGGE指紋圖譜進行聚類分析，結果表明，各樣品間的相似性在9%～67%，說明冬尖在發(fā)酵過程中，細菌群落結果發(fā)生了較大改變，其中第2年和第3年冬尖樣品的相似性最高，為67%，而第1年與第2年冬尖的相似性最低僅9%。從DGGE圖譜上切割回收19 條條帶，測序結果表明，資中冬尖在發(fā)酵過程中，所涉及的細菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門、變形桿菌門和非培養(yǎng)菌。其中厚壁菌門細菌類群為優(yōu)勢菌，占53%，其次是變形桿菌門，占37%，最少的為非培養(yǎng)菌，占10%。董玲等[9]采用16S rDNA-RFLP方法對腌制4 a的南充冬菜進行了細菌多樣性分析，結果表明發(fā)酵4 a的南充冬菜，其細菌結構也主要分為3類，分別為變形桿菌門、后壁門和放線菌門，其中以變形桿菌門細菌類群為優(yōu)勢菌群。從本研究分離菌株所屬類別可以看出，資中冬尖在發(fā)酵過程中，存在大量中度嗜鹽菌和芽孢桿菌科類群，這可能與資中冬尖發(fā)酵過程中形成的高鹽厭氧環(huán)境有關。芽孢桿菌可以產(chǎn)生抗逆性極強的內(nèi)生芽孢來度過不利的生長條件，因此即使是在高鹽厭氧這種惡劣的環(huán)境中也可以生長繁殖，此外，芽孢桿菌具有較好的抑菌防病作用，有利于冬尖發(fā)酵的防腐。中度嗜鹽菌分布在很多屬中，主要生活在海洋、鹽場、鹽湖和腌制品等高鹽環(huán)境中[36]。資中冬尖的鹽濃度在16%左右，在這種高鹽環(huán)境中，大多數(shù)微生物的生長都受到了抑制，但卻非常適合中度嗜鹽菌的生長，因此在冬尖發(fā)酵樣品中檢測出大量中度嗜鹽菌，包括：Halanaerobium fermentans、Alkalibacillus salilacus、抱川芽孢桿菌（Bacillus pocheonensis）、鹽脫硝枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans）、冰下鹽單胞菌（Halomonas subglaciescola）、沉積物枝芽孢桿菌（Virgibacillus sediminis）。

根據(jù)測序結果，對DGGE指紋圖譜中條帶在不同樣品中出現(xiàn)的情況進行分析。條帶1和3的測序結果分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（100%）和Azospirillum oryzae（99%）的近源種，結合DGGE指紋圖譜可以看出，條帶1和3在入池之前的冬尖樣品中出現(xiàn)，但條帶亮度均較暗，隨著發(fā)酵時間的延長，條帶在第1、2年冬尖樣品中消失，但在第3年樣品中又重新出現(xiàn)，且條帶3為第3年冬尖樣品中的優(yōu)勢菌。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是條帶1和3在第1、2年樣品中屬于弱勢菌群，而DGGE一般只能檢測出在總的微生物群落中占1%以上的種群，而對弱勢菌群不能檢測出。萬波等[8]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對資中冬尖發(fā)酵1、2、3 a的樣品進行了微生物群落的研究，結果表明乳酸菌在資中冬尖發(fā)酵過程中受到了抑制并不是主要菌群。條帶9和10測序結果分別為Lactobacillus rennini（99%）和消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）（99%）的近源種。資中冬尖的鹽含量在16.1%左右，而一般認為鹽含量低于12%有利于乳酸菌的生長，高于12%乳酸菌生長受到抑制。從DGGE指紋圖譜可以看出，條帶9和10是入池之前冬尖樣品中的優(yōu)勢菌，條帶較亮，但隨著發(fā)酵時間的延長，條帶消失或者變暗，說明乳酸菌在冬尖發(fā)酵過程中受到了抑制，此結果與萬波等[8]研究結果相一致。條帶11為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）（100%）的近源種，只存在于入池前冬尖樣品中，在發(fā)酵過程中消失。根癌農(nóng)桿菌是一種嚴重危害植物生長的病害，能感染雙子葉植物的受傷組織，引起冠癭瘤，資中冬尖的原料芥菜屬于雙子葉植物，容易受根瘤農(nóng)桿菌的侵染，冬尖在發(fā)酵過程中形成了高鹽厭氧環(huán)境，可能正是這種惡劣的環(huán)境抑制了根瘤農(nóng)桿菌在發(fā)酵過程中的生長。綜上所述，采用PCR-DGGE技術能更直觀、更全面地展現(xiàn)冬尖發(fā)酵過程中細菌群落結構及其動態(tài)變化，為冬尖生產(chǎn)工藝及其風味形成原理提供理論依據(jù)。

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PCR-DGGE Analysis of Bacterial Diversity during Fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese Traditional Fermented Vegetable Product

WANG Miao, LI Zhang, SUN Qun*
(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Objective： To investigate dynamic changes in the microbial community structure during the fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese traditional fermented vegetable product, by polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Methods： Four samples of Dongjian with different fermentation times were collected from Zizhong, Sichuan province. Total bacterial DNA was extracted from the samples, and nested PCR was applied to amplify the V3 region of 16S rDNA for identification based on DGGE fingerprints. Meanwhile, the dominant bands were cloned, selected and sequenced, and a phylogenetic tree was constructed. Results： During the fermentation process of Dongjian, rich bacterial diversity was observed and the microbial community structure was changed greatly. The similarity of bacterial community between Dongjian samples with different fermentation times ranged from 9% to 67%. Among them, samples fermented for two and three years exhibited the highest similarity to each other, up to 67%. Furthermore, the bacteria involved in the fermentation process of Dongjian were mainly divided into3 categories： Firmicutes, Proteobacteria, and unculturable bacteria. Among these, Firmicutes was the most dominant species followed by Proteobacteria, which accounted for 53% and 37% of the total population, respectively, while unculturable bacteria accounted for only 10%. Conclusions：DGGE fingerprint can provide a comprehensive and true reflection of dynamic changes in the microbial diversity of Dongjian during fermentation. Meanwhile, it also provides a theoretical basis for the production process for Dongjian and the formation of flavor substances.

Dongjian; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis; bacterial diversity

10.7506/spkx1002-6630-201712018

TS201.3

A

1002-6630（2017）12-0119-06

汪淼, 李張, 孫群. PCR-DGGE分析資中冬尖發(fā)酵過程中細菌多樣性[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 119-124.

10.7506/ spkx1002-6630-201712018 http：//www.spkx.net.cn

WANG Miao, LI Zhang, SUN Qun. PCR-DGGE analysis of bacterial diversity during fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese traditional fermented vegetable product[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 119-124. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712018. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-07

汪淼（1987—），女，碩士，研究方向為微生物檢測。E-mail：wangmiaosichuan@163.com

*通信作者：孫群（1967—），女，教授，博士，研究方向為微生物技術與食品安全。E-mail：qunsun@scu.edu.cn