董麗萍，黃達(dá)，甘廖英，劉光敏，王加杰，蔡維君*

（1中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，長沙 410013；2長沙醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，長沙醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，長沙 410219）

動脈不同剪切力實驗動物模型的建立

董麗萍1,2，黃達(dá)1，甘廖英1，劉光敏1，王加杰1，蔡維君1*

（1中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，長沙 410013；2長沙醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，長沙醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，長沙 410219）

目的尋找一種簡單、準(zhǔn)確的方法建立動脈的不同剪切力動物模型，為研究剪切力在心血管系統(tǒng)中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，即頸總動脈結(jié)扎組、股動靜脈吻合組和髂總動脈結(jié)扎組，每組又分為手術(shù)組和假手術(shù)組（對照組），利用多普勒超聲儀檢測手術(shù)前后動脈血流，估算血流剪切力的變化。利用免疫熒光組織化學(xué)法檢測不同剪切力下血管內(nèi)皮eNOS的表達(dá)情況。結(jié)果頸總動脈結(jié)扎法大鼠死亡率高；股動靜脈吻合法手術(shù)耗時長，且因動脈太小不易測得股動脈血流；單側(cè)髂總動脈結(jié)扎手術(shù)可以使雙側(cè)髂總動脈分別形成不同血流剪切力。單側(cè)髂總動脈結(jié)扎術(shù)后，結(jié)扎側(cè)髂總動脈內(nèi)皮eNOS免疫反應(yīng)性減弱，而結(jié)扎對側(cè)eNOS免疫反應(yīng)性增強(qiáng)。結(jié)論單側(cè)髂總動脈結(jié)扎手術(shù)簡單易操作，髂總動脈血流速度通過多普勒超聲儀可獲得，是制作不同剪切力動物模型的最佳方法。

剪切力；動物模型；結(jié)扎；吻合

血液流動過程產(chǎn)生的剪切力在血管穩(wěn)態(tài)的維持、動脈粥樣硬化的發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用[1]。對于剪切力在心血管系統(tǒng)的作用及機(jī)制的研究大多都是在體外應(yīng)用流體剪切力培養(yǎng)系統(tǒng)給予培養(yǎng)的細(xì)胞不同剪切力進(jìn)行[2,3]。雖然體外研究可以單獨研究某一因素的作用，而體內(nèi)微環(huán)境復(fù)雜，體外研究并不能代替體內(nèi)研究，也不能說明生理條件下某一因素的作用。本研究力圖尋找一種簡單、準(zhǔn)確的方法建立動脈的不同剪切力動物模型，為在體研究剪切力在心血管系統(tǒng)中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 頸總動脈結(jié)扎法

12只3月齡SD大鼠（250～300g）分為假手術(shù)組和結(jié)扎組，結(jié)扎組大鼠行單側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除頸部毛發(fā)，沿大鼠頸部中線剪開皮膚，鈍性分離肌肉，找到頸總動脈及其伴行靜脈，分離一側(cè)頸總動脈并用5-0手術(shù)縫合線結(jié)扎（圖1），傷口處給予抗生素，3-0手術(shù)縫合線縫合皮膚。

2 股動靜脈吻合法

圖2 大鼠股動靜脈吻合法示意圖。A，股動靜脈吻合模式圖；B，股動靜脈吻合實物圖Fig. 2 Rat FAVA. A, schematic diagram; B, operation picture

圖3 大鼠髂總動脈結(jié)扎法示意圖。A，髂總動脈結(jié)扎模式圖；B，髂總動脈結(jié)扎實物圖Fig. 3 Rat CIAL. A, schematic diagram; B, operation picture

6只3月齡SD大鼠（250～300g），對其左側(cè)行股動靜脈吻合手術(shù)，右側(cè)行假手術(shù)作為對照。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除腹股溝部位毛發(fā)，沿大鼠腹股溝切開皮膚，找到股動靜脈并分離，體視顯微鏡下在股動靜脈上各剪開一小口，然后用10-0手術(shù)縫合線吻合動靜脈（圖2）。傷口處給予抗生素，3-0手術(shù)縫合線縫合皮膚。

3 髂總動脈結(jié)扎法

12只3月齡SD大鼠（250～300g）分為假手術(shù)組和結(jié)扎組，結(jié)扎組大鼠行單側(cè)髂總動脈結(jié)扎手術(shù)。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除腹部毛發(fā)，沿大鼠下腹部中線切開皮膚和肌肉，找到腹主動脈和髂總動脈，分離一側(cè)髂總動脈并用5-0手術(shù)縫合線結(jié)扎（圖3）。傷口處給予抗生素，3-0手術(shù)縫合線分別縫合肌肉和皮膚。

所有動物在術(shù)前、術(shù)后利用頻譜多普勒儀測量血流、血管直徑等數(shù)據(jù)，根據(jù)公式計算并比較髂總動脈剪切力大小。

4 免疫熒光染色

在髂總動脈結(jié)扎術(shù)后7d，取雙側(cè)髂總動脈，入4%多聚甲醛固定，30%蔗糖沉糖，冰凍切片（片厚10μm），應(yīng)用免疫熒光染色檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）的表達(dá)。一抗：eNOS (1∶100)，生物素化二抗（1∶200），熒光標(biāo)記的鏈酶親和素（1∶1000），用DAPI（2μg/ml）染核。熒光顯微鏡（Leica，AF6000）觀察并拍照。

5 數(shù)據(jù)處理

用Image Pro Plus 6.0 (IPP)分析免疫熒光染色結(jié)果圖片，測量每張照片的累積光密度和面積，計算出平均光密度。所有數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。

結(jié) 果

1 頸總動脈結(jié)扎組大鼠死亡率高

9只SD大鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后，次日死亡3只，另外的6只也陸續(xù)死亡。死亡率高達(dá)100%。

2 股動靜脈吻合組大鼠血流速度不易測得

股動靜脈吻合術(shù)后，大鼠存活率100%，但是在手術(shù)過程中血管夾對血管造成損傷，而且用頻譜多普勒儀測量血流速度時，因血管管徑小測不到而無法計算切應(yīng)力的大小。

3 髂總動脈結(jié)扎組大鼠結(jié)扎側(cè)髂總動脈血流速度降低而結(jié)扎對側(cè)血流速度加快

髂總動脈結(jié)扎術(shù)后，大鼠存活率100%，頻譜多普勒結(jié)果顯示，與假手術(shù)組血流速度（48.6±2.441）相比，結(jié)扎組大鼠結(jié)扎對側(cè)髂總動脈血流速度加快（78.00±2.236），結(jié)扎側(cè)血流微弱（6.44±0.25）（圖4）。血流剪切力τ可通過如下公式計算：τ＝4μQ/πr3[6]，由此可見，剪切力大小取決于血液粘度（μ）、血流量（Q）及血管內(nèi)徑（r），而血流量（Q）的大小取決于血流速度和血管橫截面積。故剪切力與血流速度成正比，血流速度越快，剪切力越大，血流速度越慢，剪切力越小。單側(cè)髂總動脈結(jié)扎組大鼠在手術(shù)前后，血液粘度和血管內(nèi)徑不變，結(jié)扎對側(cè)髂總動脈血流速度加快，故剪切力增大，結(jié)扎側(cè)血流速度減慢，故剪切力減小。

4 切應(yīng)力與髂總動脈內(nèi)皮eNOS免疫反應(yīng)性呈正相關(guān)

對髂總動脈內(nèi)皮eNOS水平進(jìn)行免疫熒光染色檢測顯示，與正常對照組相比，結(jié)扎后7d結(jié)扎對側(cè)髂總動脈內(nèi)皮eNOS免疫反應(yīng)性增強(qiáng)上調(diào)，而結(jié)扎側(cè)髂總動脈內(nèi)皮eNOS免疫反應(yīng)性降低且呈點狀分布(圖5)。

討 論

血流切應(yīng)力是血流與管壁摩擦產(chǎn)生的平行于管壁的切應(yīng)力，在調(diào)節(jié)著血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)和功能等方面發(fā)揮重要的作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，動脈彎曲處和分支處的切應(yīng)力低且是湍流，是動脈粥樣硬化斑塊的易發(fā)部位，而動脈的直行部位切應(yīng)力高且是層流，不容易形成斑塊[4,5]。對于剪切力在心血管系統(tǒng)的作用及機(jī)制的研究大多都是在體外應(yīng)用流體剪切力培養(yǎng)系統(tǒng)給予培養(yǎng)的細(xì)胞不同剪切力進(jìn)行[2,3]。本研究力圖尋找一種簡單、準(zhǔn)確的方法建立動脈不同剪切力動物模型，為在體研究剪切力在心血管系統(tǒng)中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖4 髂總動脈結(jié)扎對血流速度的影響。A，假手術(shù)組髂總動脈血流速度；B，單側(cè)髂總動脈結(jié)扎對側(cè)髂總動脈血流速度加快；C，單側(cè)髂總動脈結(jié)扎側(cè)髂總動脈血流速度降低；D，各組血流速度的比較，*，與假手術(shù)組相比，P＜0.01Fig. 4 The efect of CIAL on blood fow velocity. A, the blood fow velocity in the common iliac artery of the sham operation group; B, after unilateral CIAL, the blood fow velocity in the contralateral common iliac artery increased; C, after unilateral CIAL, the blood velocity in the ligated artery decreased; D, comparison of the blood fow velocity in the common iliac artery among the three groups; *, P＜0.01, compared with the sham group

圖5 髂總動脈結(jié)扎對髂總動脈內(nèi)皮內(nèi)eNOS免疫反應(yīng)性的影響。A，正常對照組髂總動脈；B，結(jié)扎后7d對側(cè)髂總動脈；C，結(jié)扎后7d同側(cè)髂總動脈；藍(lán)色：細(xì)胞核；紅色，eNOS免疫反應(yīng)性；D，髂總動脈結(jié)扎對髂總動脈內(nèi)皮內(nèi)eNOS免疫反應(yīng)性影響的統(tǒng)計學(xué)分析比較； *，與正常對照組相比，P＜0.01；比例尺，200μmFig. 5 The efect of CIAL on the expression of eNOS in common iliac arterial epithelium. A, eNOS expression in the control group; B, eNOS expression in the contralateral iliac artery 7d after ligation; C, eNOS expression in the ligated common iliac artery 7d after ligation; D, statistical analysis of eNOS immunoreactivity in the three groups; blue, cell nucleus; red, positive expression of eNOS; *, P＜0.01, compared with the control group; scale bar, 200μm

頸總動脈結(jié)扎法動物存活率低，不利于用于制作不同剪切力動物模型。股動靜脈吻合法對操作者要求高，耗時較長，一般需要3h以上，手術(shù)過程中血管夾易損傷血管管壁，且近吻合處易形成小血栓從而影響血流，再加上因血管管徑小不易測得血管內(nèi)血流速度等數(shù)值，此方法也不是理想的制作不同剪切力動物模型的方法。相比這兩種方法，髂總動脈結(jié)扎法操作簡單，動物存活率高。另外，髂總動脈管徑較大，動脈內(nèi)血流速度等數(shù)據(jù)可用多普勒儀檢測，可準(zhǔn)確計算血流剪切力。髂總動脈結(jié)扎組大鼠髂總動脈血流剪切力τ可通過如下公式計算：τ＝4μQ/πr3[6]，由此可見，剪切力大小取決于血液粘度（μ）、血流量（Q）及血管內(nèi)徑（r），而血流量（Q）的大小取決于血流速度和血管橫截面積。故剪切力與血流速度成正比，血流速度越快，剪切力越大，血流速度越慢，剪切力越小。單側(cè)髂總動脈結(jié)扎組大鼠在手術(shù)前后，血液粘度和血管內(nèi)徑不變，結(jié)扎對側(cè)髂總動脈血流速度加快，故剪切力增大，結(jié)扎側(cè)血流速度減慢，故剪切力減小。

心血管疾病的發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)。而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在很大程度上是由于血管舒張劑一氧化氮（Nitric oxide, NO）的產(chǎn)生和生物利用率降低，導(dǎo)致動脈舒張功能受損。NO是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種關(guān)鍵血管舒張劑。生理學(xué)上，NO調(diào)節(jié)血管舒張、抑制血管炎癥、血栓形成和異常的細(xì)胞增殖[7]。血管NO生物利用率的整體下降主要是由eNOS活性顯著下降，它可被血流剪切力激活[8]。本研究中免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，高剪切力作用下，血管內(nèi)皮eNOS表達(dá)上調(diào)，低剪切力作用下，血管內(nèi)皮eNOS表達(dá)下降，與以往的研究結(jié)果一致[9]。

由此可見，通過單側(cè)髂總動脈結(jié)扎可獲得不同剪切力動物模型，是制作不同剪切力實驗動物模型比較理想的方法。

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Establishment of experimental animal models of different shear stress

Dong Liping1,2, Huang Da1, Gan Liaoying1, Liu Guangmin1, Wang Jiajie1, Cai Weijun1*
（1Department of Histology and Embryology, School of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410013, China;2Department of Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Neuroscience, Changsha Medical University, Changsha 410219, China）

ObjectiveTo explore a simple and easy method of establishing animal models of diferent shear stress in the arteries for purpose of studying the role of shear stress in the cardiovascular system and its mechanism.Methods30 SD rats were randomly divided into three groups, the common carotid artery ligation (CCAL) group, femoral artery-vein anastomosis (FAVA) group and common iliac artery ligation (CIAL) group. Each group was further divided into an operation group and a sham operation group (control group). The arterial blood fow was detected before and after operation by Doppler ultrasound, and the change in blood fow shear stress estimated. The expression of eNOS in vascular endothelium under diferent shear stress was detected by immunofuorescence histochemistry.ResultsThe mortality rate was high in CCAL group. FAVA was time-consuming, and the blood fow was not easy to measure in the narrow femoral artery. Unilateral CIAL generated diferent blood fow shear stress in bilateral common iliac arteries, after which the immunoreactivity of eNOS in the endothelium of the ligated common iliac artery decreased while that of the contralateral iliac artery increased.ConclusionUnilateral CIAL is simple and easy to perform. The blood fow velocity in the common iliac artery is measurable by Doppler ultrasound. Therefore unilateral CIAL is the optimum method of establishing animal models of diferent shear stress.

Shear stress; animal model; ligation; anastomosis

R329

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017.02.014

2016-12-04

2017-03-25

湖南省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目（C2016052）；湖南省教育廳科學(xué)研究一般項目（16C0163）

董麗萍，女（1984年），漢族，講師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：wjcai@yahoo.com