趙耀+李玲+劉飛揚(yáng)+羅思芹+曹珂珂

摘 要：該研究從自然界中篩選出產(chǎn)廣譜乳酸菌素的乳酸菌，利用單層瓊脂平板打孔抑菌法篩選。所篩選的產(chǎn)細(xì)菌素C1菌株鑒定為乳球菌屬（Lactococcus），排除有機(jī)酸和過(guò)氧化氫等干擾后，發(fā)酵上清液仍有較強(qiáng)的抑菌性質(zhì)；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，發(fā)酵上清液的抑菌性急劇下降，證明該乳酸菌素具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，是一種乳酸菌細(xì)菌素。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，該乳酸菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，具有廣譜抑菌性。

關(guān)鍵詞：乳酸菌素；乳酸菌；選育；鑒定

中圖分類號(hào) Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）11-0052-03

Screening for Lactic Acid Bacteria Producing Broad-spectrum Bacteriocin

Zhao Yao et al.

（College of Food and Biological Engineering，Bengbu University，Bengbu 23030，China）

Abstract：To screen the lactic acid bacteria produced by the broad spectrum lactic acid bacteria from nature，single layer agar plate pore inhibition method was used. The bacteriocin-isolated bacteriocin-C1 strain was identified as Lactococcus，the excretion of organic acids and hydrogen peroxide，and the fermentation broth still had strong antibacterial properties. After treatment with pepsin and trypsin，the bacteriostasis of the liquid decreased sharply，which proved that the lactic acid bacteriumhad the protein property and were lactic acid bacterium. In vitro antibacterial experiments showed that thelactic acid bacteria on Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria had antibacterial effect，with broad-spectrum antimicrobial.

Key words：Bacteriocin；Lactic acid bacteria；Breeding；Identification

乳酸菌形態(tài)各異，在食品、藥品等行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。乳酸菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和乳酸菌素等物質(zhì)，其中乳酸菌素發(fā)揮著重要的作用，它可以抑制啤酒腐敗、延長(zhǎng)食品保藏時(shí)間，同時(shí)在臨床上用于治療腹脹、腹瀉、胃炎等癥，改善腸道環(huán)境。乳酸菌素作為生物防腐劑，因其具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，引起了廣大從事菌種研究領(lǐng)域人員的熱議，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-6]。本實(shí)驗(yàn)從泡菜中經(jīng)過(guò)大量的篩選，獲得一株C1菌株，該菌株產(chǎn)生的乳酸菌素具有廣譜抑菌效果，經(jīng)過(guò)排酸實(shí)驗(yàn)和排過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)后仍有很強(qiáng)的抑菌性，用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后抑菌性大幅度降低，說(shuō)明其抑菌物質(zhì)是細(xì)菌素。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制效果，對(duì)酵母菌和霉菌無(wú)抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源材料 泡菜、酸奶。指示菌：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、黑曲霉、毛霉。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基（上海星科生物科技有限公司）、PYG培養(yǎng)基（江蘇菲亞生物科技有限公司）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 BHC-1300生物潔凈安全柜、JW-3021H高速離心機(jī)、XMT-A700恒溫培養(yǎng)箱、DY04-13-44-00臺(tái)式壓力蒸汽滅菌器、BC-50S美菱冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的富集與分離 將泡菜、酸奶加入錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。富集液10倍遞增稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋液各300μL，涂布于含有碳酸鈣的MRS平板上培養(yǎng)，挑取溶鈣圈較大的菌落在MRS平板上劃線分離，選取菌落大小、顏色、形狀均一致、革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性菌株，備用。

1.2.2 產(chǎn)乳酸菌素乳酸菌的初篩 將分離到的乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，4℃，6000r/min，離心15min，取上清液備用。將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌懸液10倍梯度稀釋涂指示菌平板。采用單層瓊脂平板打孔法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)[7]，用直徑6mm打孔器在指示菌平板上均勻打出4個(gè)孔，取0.1mL發(fā)酵上清液注入小孔中，室溫下靜置4h后，37℃培養(yǎng)12h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3 產(chǎn)乳酸菌素乳酸菌的復(fù)篩[8] （1）酸排除實(shí)驗(yàn)：取pH4.5作為乳酸抑制作用的最小pH，調(diào)節(jié)初篩菌株的發(fā)酵上清液pH至4.5，以相應(yīng)pH值的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。（2）過(guò)氧化氫排除實(shí)驗(yàn)：挑取排除酸作用后仍具有較強(qiáng)抑菌效果的菌株，將其發(fā)酵上清液于80℃加熱10min后，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。（3）蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)：挑取排除酸、過(guò)氧化氫干擾后，抑菌活性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)，調(diào)節(jié)菌株pH為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用的最適pH值7.0，按終濃度為1mg/mL加入各酶，37℃溫育2h，將pH值調(diào)到4.5后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 菌株鑒定[9] （1）個(gè)體形態(tài)和菌落特征，進(jìn)行菌株革蘭氏染色、個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài)的培養(yǎng)與觀察。（2）理化性質(zhì)鑒定，對(duì)菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、伏譜實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、氧利用實(shí)驗(yàn)、葡聚糖產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)、牛奶實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)條件測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、毛霉和黑曲霉進(jìn)行單層平板打孔抑菌實(shí)驗(yàn)，真菌25℃，細(xì)菌30℃培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的富集與分離 從富集液中分離9株菌株，實(shí)驗(yàn)證明，這9株菌都是革蘭氏陽(yáng)性菌，過(guò)氧化氫酶接觸陰性，符合乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 產(chǎn)廣譜乳酸菌素乳酸菌的初篩 9株乳酸菌中有A2、C1、C3 3株菌株出現(xiàn)較大抑菌圈，如表1所示，篩選出的3株乳酸菌上清液對(duì)于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有抑菌效果，所篩乳酸菌上清液既抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，也抑制革蘭氏陰性菌。

2.3 產(chǎn)廣譜乳酸菌素乳酸菌的復(fù)篩

2.3.1 排酸實(shí)驗(yàn) 乳酸菌對(duì)其他菌株產(chǎn)生的抑菌效果可能是自身代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸產(chǎn)生的效果，也可能是代謝生成的乳酸菌素產(chǎn)生的效果，調(diào)節(jié)篩選的菌株發(fā)酵液的pH為4.5，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，如表2所示，對(duì)照組（pH為4.5的MRS空白培養(yǎng)基）的抑菌圈直徑比其他兩組小，說(shuō)明這2組乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中排除有機(jī)酸后仍有其他抑菌物質(zhì)[10]。

2.3.2 過(guò)氧化氫排除實(shí)驗(yàn) 乳酸菌在自身代謝過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫也可能抑制其他微生物的生長(zhǎng)[11]，所以為排除其干擾，上述兩組發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)80℃水浴加熱10min，將發(fā)酵液中的過(guò)氧化氫充分分解，冷卻至常溫后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以發(fā)酵上清液原液作為對(duì)照組。抑菌結(jié)果顯示（如表3），C1、C3菌株的抑菌圈直徑與排酸實(shí)驗(yàn)大小幾乎相同，排除過(guò)氧化氫干擾后，這兩個(gè)菌株仍然有抑菌作用，說(shuō)明C1、C3菌株產(chǎn)生的抑菌效果是由其他抑菌物質(zhì)產(chǎn)生。

2.3.3 蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn) 選出抑菌效果最強(qiáng)的C1菌株進(jìn)行蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以發(fā)酵上清液原液作為對(duì)照組。由表4可知，乳酸菌C1的發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)酶處理后，對(duì)2種指示菌的抑菌效果明顯降低，說(shuō)明此發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，該抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素[12]。

2.4 產(chǎn)廣譜乳酸菌素乳酸菌的分類與鑒定

2.4.1 乳酸菌C1的形態(tài) 篩選的菌株其菌體細(xì)胞呈球狀，單個(gè)或成對(duì)存在，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢。菌落表面光滑，邊緣整齊，乳白色不透明[13]。

2.4.2 乳酸菌C1的理化性質(zhì) 該乳酸菌經(jīng)過(guò)一系列的理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、伏譜實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)均為陰性，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖均為紅色，肌醇淡黃色。C1菌株在溫度條件實(shí)驗(yàn)中，10℃下生長(zhǎng)遲緩，35℃下生長(zhǎng)狀況良好，45℃不生長(zhǎng)；C1菌株在耐鹽實(shí)驗(yàn)中，NaCl濃度為2%、4%的環(huán)境下可以生長(zhǎng)，6.5%濃度下不生長(zhǎng)；C1菌株在酸堿環(huán)境實(shí)驗(yàn)中，pH在4.3和6.8時(shí)生長(zhǎng)，在9.5時(shí)不生長(zhǎng)。根據(jù)上述形態(tài)觀察、理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和菌種生長(zhǎng)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[14]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]，初步確定C1菌株為乳球菌屬（Lactococcus）。

2.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 由表5可知，C1菌株上清液對(duì)大腸桿菌、單增李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌均有抑菌效果，說(shuō)明C1菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用；但該上清發(fā)酵液對(duì)酵母菌和霉菌無(wú)抑制作用。所以C1菌株代謝產(chǎn)生的乳酸菌素具有一定的廣譜抑菌性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從泡菜中選出9株乳酸菌，這些菌落都為乳白色或者淺黃色、濕潤(rùn)、光滑、菌落突起、邊緣整齊，而且革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)為陰性。菌落四周的溶鈣圈較大，都符合乳酸菌的特性。

9株乳酸菌中有A2、C1、C33株菌株在單層瓊脂平板打孔抑菌實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生抑菌圈。然后進(jìn)行復(fù)篩，在排除有機(jī)酸和排過(guò)氧化氫因素影響后，對(duì)抑菌效果較好的C1菌株進(jìn)行蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)，用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，發(fā)酵上清液的抑菌性急劇下降，證明該乳酸菌素具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，根據(jù)細(xì)菌素的定義可知，C1菌株的抑菌物質(zhì)是乳酸菌細(xì)菌素。菌株理化性質(zhì)初步鑒定C1菌株為乳球菌屬（Lactococcus）。

經(jīng)過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)確定C1菌株產(chǎn)生的乳酸菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（單增李斯特氏菌等）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌等）均有抑制作用，對(duì)毛霉和黑曲霉并無(wú)明顯抑制作用，具有廣譜抑菌性。

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