黃蘭平,靳麗萍,謝佳妮,張應烙

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

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佛手的1H-NMR指紋圖譜研究

黃蘭平,靳麗萍,謝佳妮,張應烙*

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

建立佛手的氫核磁共振(1H-NMR)指紋圖譜,為判別不同來源的佛手藥材及其質量提供依據。利用核磁共振儀測定不同產地的佛手,對NMR數據分別進行相似度法、聚類分析和主成分分析法評價。結果表明:金佛手和川佛手的相關系數均在0.95以上,而與廣佛手的相似度較低,相關系數均在0.86以下;金佛手和川佛手中的檸檬內酯相對含量要比廣佛手多;聚類分析結果也說明廣佛手與金佛手及川佛手能夠明顯分開,而金佛手與川佛手比較相似;主成分分析得到四個主成分,其累計貢獻率達到95.352%。該方法可以快速簡便地區(qū)分不同品種的佛手,可為佛手的質量控制及使用提供參考。

1H-NMR指紋圖譜,佛手,聚類分析,主成分分析

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle),別名枸櫞、枸櫞子、香泡,屬于蕓香科柑橘屬植物,主要分布于熱帶和亞熱帶,我國浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地均有栽培[1]。根據出產地不同,佛手可分為多個品種:產于廣東、廣西的藥用佛手稱為“廣佛手”,產于浙江金華的稱“金佛手”,產于四川等地稱“川佛手”。佛手具有較高食用和藥用價值,藥理實驗表明其具有止咳平喘、改善心血管系統(tǒng)、免疫調節(jié)和抗腫瘤等作用[2-3],在臨床上廣佛手、川佛手和金佛手均可入藥,然而大量研究結果表明,不同產區(qū)、品種的佛手化學成分差異明顯[4-7],會影響臨床療效[2]。

隨著氫核磁共振技術(Proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR)發(fā)展,1H-NMR靈敏度逐步提高,核磁技術也隨之用于藥物分析中,且該法已被收載于2010 年版《中國藥典》附錄中[8]。1H-NMR指紋譜與傳統(tǒng)HPLC指紋譜相比,可以直接提供結構信息,無需標準品,無須復雜前處理和預分離[9-10]。本文通過建立佛手的氫核磁共振(1H-NMR)指紋圖譜,為判別不同來源的佛手藥材及其質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒸餾水,95%乙醇 分析純,北京化工廠;DMSO-d6Cambridge Isotope公司;不同產地的佛手 廣東肇慶(A)、廣西桂林(B)、金華赤松鎮(zhèn)(C)、金華羅店鎮(zhèn)(D)、四川樂山(E)、四川蘆山(F)、重慶江津(G)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600型超導傅立葉變換NMR譜儀 瑞士Bruker公司;AS7240B型超聲器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;BSl24S型1/1萬電子天平 德國Sartorius;RZ-52B旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 供試樣品溶液的配制

供試樣品干佛手粉碎后過60目篩,精密稱取佛手樣品粉末8 g,加95%乙醇300 mL進行超聲提取2次。每次1 h,合并提取液后過濾得濾液,用旋轉蒸發(fā)儀旋干溶劑得粗浸膏,45 ℃烘箱烘干粗浸膏減少溶劑乙醇的影響。取20 mg上述粗浸膏,溶解于0.5 mL DMSO-d6中。

1.31H-NMR測試條件

采用zg30脈沖序列采集1.2制備的供試樣品溶液的1H-NMR圖譜。測定溫度298 K,觀測頻率600.13 MHz,譜寬5101.1 Hz,采樣數據點65536,掃描次數4次,TMS為內標。

1.41H-NMR圖譜處理

分段積分法:應用MetresNova軟件進行分段積分,選擇δ0.70～8.14范圍的1H-NMR圖并以每δ0.04 作為1個單位進行分段積分,得到各化學位移段與之相對應的信號峰面積值,以ASCII格式輸出數據。本實驗共獲得180段積分(扣除水峰信號δ3. 26～3. 34、DMSO溶劑峰信號δ2.50～2.54和提取溶劑乙醇殘留峰信號δ1.02～1.10及δ3.54～3.58)。將獲得的數據矩陣(180個變量× 7個樣品),根據相似度計算原理,利用Excel 2007軟件進行相似度分析,導入SPSS軟件進行聚類分析。

共有峰積分法:選取圖1中不重疊的18個質子信號峰作為共有峰,計算積分面積,獲得共有峰面積值,導入SPSS軟件進行主成分分析(PCA)。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度實驗 取同一份佛手供試樣品溶液,在上述1H-NMR按1.3項測試條件下連續(xù)6次測定指紋圖譜,用MetresNova軟件處理圖譜,采用1.4項下的積分方法得到一系列相對峰面積積分值。計算6組數據之間的相關系數,分析儀器精密度。

1.5.2 重復性實驗 按1.2項方法下配制同一批次佛手供試樣品溶液6份,按1.3項下條件測試1H-NMR指紋圖譜,用1.4項下方法處理圖譜,計算6組數據相對峰面積積分值之間的相關系數,考察其重復性情況。

1.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一份佛手供試樣品溶液,分別在0、1、2、3、4、5 d按1.3項下條件測試1H-NMR指紋圖譜,用1.4項下計算6組數據相對峰面積積分值之間的相關系數。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

精密度實驗中分段積分法計算相差系數結果均在0.99以上,表明儀器是精準的。重復性實驗中相關系數計算結果均在0.99以上,表明該方法的重復性良好。穩(wěn)定性實驗中相關系數計算結果均在0.99以上,表明供試樣品溶液在6 d內穩(wěn)定。

2.21H-NMR指紋圖譜

通過MetresNova軟件處理圖譜后得到7批佛手樣品的1H-NMR指紋圖譜(圖1)。通過直觀分析,可以看到廣佛手(廣東肇慶、廣西桂林)、金佛手(金華赤松鎮(zhèn)、金華羅店鎮(zhèn))、川佛手(四川樂山、四川蘆山、重慶江津)3個不同品種佛手提取物1H-NMR在大部分場區(qū)的輪廓大致相同,均含有黃酮類、糖類、有機酸類和脂肪酸類成分。但在部分場區(qū)仍有一定差異,例如在高場區(qū)(δ0.5～1.5,扣除δ1.1左右的乙醇殘留三重峰),廣佛手與川佛手有一定的差別,表明它們的有機酸及脂肪酸類等成分有差別;在δ3.3～3.6的區(qū)域中,不同基原的一些信號峰的強度存在著一定差異,廣佛手在該區(qū)域中的信號峰強度明顯弱于其他2個品種,表明3個基原品種間的化學成分含量有一定的差異。

圖1 7批不同來源佛手樣品溶液的典型1H-NMR指紋圖譜及其δ7.5～8.5局部放大圖Fig. 1 1H-NMR fingerprint of 7 batches sample solution of C. medica from different origins and partial enlarged detail between δ7.5～8.5注:A. 廣東肇慶;B. 廣西桂林;C. 金華赤松鎮(zhèn);D. 金華羅店鎮(zhèn);E. 四川樂山;F. 四川蘆山;G. 重慶江津;H. 檸檬內酯。

已有研究表明檸檬內酯(又稱檸檬油素)(分子結構式見圖2)在佛手藥材中含量較高,是金佛手、廣佛手和川佛手中的一個主要的次級代謝產物,并且現代藥理實驗證明檸檬內酯為佛手藥材的主要有效成分之一[7],所以可將檸檬內酯作為佛手藥材質量評價的指標之一,本實驗從金佛手提取物中分離出該化合物,其氫譜圖參見圖1,具體的氫譜數據如下:1H-NMR(DMSO-d6,600.13 MHz)δ:8.02(1H,d,J=9.7 Hz,H-4),6.53(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.20(1H,d,J=9.7 Hz,H-3),6.62(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),3.87和3.91(各3H,s,OCH3×2),其波譜數據與文獻[11]基本一致,可以鑒定該化合物為5,7-二甲基香豆素(檸檬內酯)。在1H-NMR中,共振峰面積或峰高與產生該共振峰的質子數成正比,這是定量的依據,可利用特征峰相對含量法對成分的含量進行宏觀分析[9]。在檸檬內酯氫譜中,化合物H-4(δ8.02)峰達到基線分離且兩側基線平坦(參見圖1),不受其它信號干擾,符合定量原則,因此,選定δ8.02峰為檸檬內酯相對含量的定量峰,從圖中可直觀看出金佛手和川佛手中的檸檬內酯相對含量要比廣佛手多,與崔紅花等[7]報道的佛手檸檬內酯含量結果稍有出入,可能與我們采用不同的提取溶劑有關。

表1 7批佛手的來源產地和相似度評價結果Table 1 Geographical source and the similarity of 7 batches raw materials of Citrus medica L.var. sarcodactylis Swingle

圖2 檸檬內酯的分子結構式.Fig.2 Molecular structure of limettin

2.3 統(tǒng)計分析

2.3.1 相似度評價 7批不同來源的佛手藥材按照1.2項下的方法制備成供試樣品溶液,采用1.3項下的條件測試上面樣品的1H-NMR,采用分段積分法進行處理1H-NMR指紋圖譜,對獲得的NMR積分面積數據矩陣進行相似度計算。選擇金華赤松鎮(zhèn)佛手的圖譜作為對照指紋圖譜,計算7批樣品的相關系數值,結果顯示金華赤松鎮(zhèn)佛手與金華羅店鎮(zhèn)佛手及3個川佛手的相關系數均在0.9537～0.9981間(見表1),而金華赤松鎮(zhèn)佛手與2個廣佛手的相似度較低,相似度為0.7969、0.8580,提示金佛手與川佛手的化學成分非常相似,而金佛手與廣佛手的化學成分存在一定差異。

2.3.2 聚類分析 采用分段積分法,以不同產地佛手藥材的1H-NMR峰面積積分值歸一化后為原始數據,SPSS 19.0軟件對相關數據進行系統(tǒng)聚類分析,采用組間平均數聯結法,以夾角余弦為樣品相似度的距離公式,聚類分析結果見圖3。由圖可知,佛手藥材被分為2大類,一類包括廣佛手A(廣東肇慶)和B(廣西桂林);另外一類包括金佛手C(金華赤松鎮(zhèn))、D(金華羅店鎮(zhèn))和川佛手E(四川樂山)、F(四川蘆山)、G(重慶江津)。因此,通過聚類分析得到的各產地佛手之間的相關性與相似度分析的結果一致,它們之間相互驗證。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

2.3.31H-NMR共有峰主成分分析 主成分分析法是一種應用廣泛的多元統(tǒng)計方法,用于簡化數據,快速實現模式或關系的可視化識別。SPSS19.0軟件對原始數據進行標準化處理,以主成分的特征值及貢獻率為依據,對7個不同產地佛手藥材的18個共有峰進行主成分分析,結果見表2和表3。

表2 抽取的主成分特征值及貢獻率Table 2 The characteristic value and contribution of principal components

由表2可知,主成分個數的提取原則為其對應的特征值大于1,故取前4個作為主成分,其累計貢獻率達到95.352%,它代表了所研究譜峰的95.352%的信息量。其中,第一主成分特征值為9.503,貢獻率為52.793%,是佛手藥材最重要的成分群。由表3可以看出,第1主成分因子與3～5、13、16～17號特征峰高度正相關,提示δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630這六個積分段峰對不同樣品的區(qū)分評價貢獻較大;第2主成分因子與18號特征峰高度正相關,說明第2主成分反映的主要是δ8.000～8.030峰的信息,即第2主成分主要反映檸檬內酯H-4峰的信息;第3和第4主成分因子分別與7號和6號特征峰高度正相關,提示它們分別反映δ3.240～3.260和δ3.090～3.140峰的信息。上述高度正相關的特征峰在佛手藥材的質量控制中有相對重要的作用,除了δ8.000～8.030峰已明確為檸檬內酯H-4峰外,其它特征峰屬于何種化合物有待于進一步的研究分析。

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component factor

綜上所述,運用聚類分析和主成分分析,可實現快速分析,發(fā)揮各自優(yōu)勢,互相驗證和補充,從多角度綜合評判佛手藥材的質量。

3 討論

建立全面、系統(tǒng)、特征性的指紋圖譜,是佛手質量評價的有效辦法。關于佛手藥材的HPLC指紋圖譜已有報道[12-13],但尚未見1H-NMR指紋圖譜研究。本實驗建立了不同產地佛手藥材1H-NMR指紋圖譜。通過相似度計算、聚類分析和主成分分析,對藥材進行綜合評價,得到較理想的結果。同時,本實驗還進行了1H-NMR指紋譜方法學考察,發(fā)現精密度、穩(wěn)定性、重復性都符合指紋圖譜的要求,為佛手藥材的質量控制提供了更全面的參考。

本實驗只表征了佛手粗提取氫譜中的一個主要次級代謝產物檸檬內酯,至于粗提取氫譜中的其它化合物表征及質量控制的關鍵成分確定,還有待于進一步的研究探討。

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Study on1H-NMR fingerprinting ofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle

HUANG Lan-ping,JIN Li-ping,XIE Jia-ni,ZHANG Ying-lao*

(College of Chemistry and Life Science,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China)

To provide the base for distinguishingCitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle from different regions and quality evaluation,the1H-NMR fingerprint analysis ofC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle was established. The samples collected from diverse geographical locations were determined by the1H-NMR method. The NMR data was evaluated by the methods of similarity analysis,cluster analysis and principal component analysis. The experimental results showed that the similarity value was above 0.95 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. However,the similarity value was with under 0.86 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The relative component of limettin inC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan were greater than that ofC.medicaL. Var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The result of cluster analysis also showedC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong was different from theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan,but theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua was similar to theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. According to the principal components analysis,four principal components was obtained,and the contribution rate of accumulative total of variance of the four factors was 95.352%.The established method was a quick,simple and useful for distinguishing different species and assessment of the quality of theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle.

1H-NMR;CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle;cluster analysis;principal component analysis

2016-12-08

黃蘭平(1996-),女,本科,主要從事天然藥物化學研究,E-mail:1239048674@qq.com。

國家自然科學基金資助項目(21002092);浙江省自然科學基金(LY17C010002);金華市科學技術研究計劃項目(2014-2-049)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)11-0291-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.047