王海芳， 趙向絨， 霍雪萍， 孫晶瑩， 武翔龍， 牛銀波， 胡 軍， 劉勤社

(1陜西省人民醫(yī)院中心實驗室， 陜西 西安 710068； 2西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院， 陜西 西安 710072； 3陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 陜西 西安 712046)

Semaphorin 3A 過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響*

王海芳1， 趙向絨1， 霍雪萍1， 孫晶瑩1， 武翔龍2， 牛銀波2， 胡 軍1， 劉勤社3△

(1陜西省人民醫(yī)院中心實驗室， 陜西 西安 710068；2西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院， 陜西 西安 710072；3陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 陜西 西安 712046)

目的： 探討semaphorin 3A (Sema 3A)對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷的影響。方法: 構(gòu)建Sema 3A過表達(dá)載體，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HUVECs，過表達(dá)效果以qPCR和Western blot法驗證；待測細(xì)胞以200 μmol/L H2O2處理4 h；qPCR法檢測炎性細(xì)胞因子水平；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平以相應(yīng)比色法檢測；細(xì)胞活力以MTT法檢測；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及Bcl-2水平以Western blot法檢測。結(jié)果: Sema 3A過表達(dá)能顯著增加H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡、炎性細(xì)胞因子分泌以及LDH和MDA含量，同時顯著抑制SOD活性和細(xì)胞活力；Sema 3A對未經(jīng)H2O2處理的HUVECs沒有損傷效應(yīng)，即其對HUVECs的損傷具有H2O2依賴性。結(jié)論: Sema 3A能顯著加重H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷，在氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

動脈粥樣硬化； Semaphorin 3A； 過氧化氫；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重危害人類健康的臨床常見病，是冠心病、腦血栓等缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。在AS發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷通常會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而觸發(fā)后續(xù)病理進(jìn)程，如巨噬細(xì)胞聚集、血管平滑肌細(xì)胞增殖及最終的動脈粥樣斑塊形成等[2-4]。Semaphorin 3A (Sema 3A)是腦信號蛋白家族的重要成員，其已被證實是一種有效的免疫調(diào)節(jié)分子，并參與調(diào)控系統(tǒng)性硬化癥的病理進(jìn)程[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Sema 3A在急性腎損傷[6]及大腦損傷[7]過程中都發(fā)揮重要作用，并能夠提高腦血管通透性[7]。然而，Sema 3A是否在氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在探討Sema 3A對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷的影響，以期為AS的防治提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

Pyrobest DNA聚合酶和Trizol試劑盒購自TaKaRa；PCEP4表達(dá)載體購自Invitrogen；ECL顯色試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；H2O2和MTT購自Sigma； Annexin V-FITC/碘化丙啶(propi-dium iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs購于ATCC；HUVECs培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞生長至融合，按1∶3比例進(jìn)行傳代[8]。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

3 實驗方法

3.1 Sema 3A過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 應(yīng)用Pyrobest DNA聚合酶對Sema3A基因的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。按照說明書操作將獲得的Sema3AcDNA插入到PCEP4表達(dá)載體中，并以Lipofectamine 2000將2 μg Sema 3A-PCEP4載體轉(zhuǎn)染至HUVECs中，同時將空載體empty-PCEP4轉(zhuǎn)染設(shè)為陰性對照組。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，換液，提取細(xì)胞總蛋白，qPCR和Western blot驗證Sema 3A的表達(dá)水平。收集留存細(xì)胞進(jìn)行其它實驗。

3.2 H2O2處理及實驗分組 上述細(xì)胞可分為3組，即Sema 3A-PCEP4轉(zhuǎn)染組、empty-PCEP4轉(zhuǎn)染組及空白對照組。3組細(xì)胞(每孔1×106個)分別經(jīng)200 μmol/L H2O2處理4 h，未經(jīng)H2O2處理的細(xì)胞設(shè)為相應(yīng)的對照組。qPCR檢測炎性細(xì)胞因子水平變化。采用試劑盒測定LDH活性、MDA含量及SOD活性。MTT法檢測細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，以Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及Bcl-2的蛋白水平。

3.3 qPCR 按照Trizol試劑盒說明書操作，提取待測細(xì)胞總RNA。將5 μg總RNA以反轉(zhuǎn)錄試劑轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以之為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s， 57 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 循環(huán)進(jìn)行40次。擴(kuò)增結(jié)果以ABI 7500系統(tǒng)檢測，并以2-ΔΔCt法定量。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

F: forward; R: reverse.

3.4 Western blot實驗 待測細(xì)胞以RIPA裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白并以BCA法定量。取40 μg總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE，并將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜經(jīng)TBST清洗后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，換液，與目的蛋白 I 抗4 ℃過夜孵育。膜再次經(jīng)TBS清洗后，換液，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(II 抗)孵育1.5 h，清洗并以ECL顯影液顯色。所用抗體為兔抗人Sema 3A多克隆抗體(稀釋度1∶1 500)、兔抗人cleaved caspase-3多克隆抗體(稀釋度1∶2 000)、兔抗人Bcl-2單克隆抗體(稀釋度1∶2 500)、兔抗人β-actin多克隆抗體(稀釋度1∶2 500)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋度1∶4 000)II 抗[9]。以上抗體均購自Abcam，其中β-actin作為內(nèi)參照。利用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件對Western blot條帶進(jìn)行量化分析。

3.5 培養(yǎng)上清液LDH活性和細(xì)胞SOD活性、MDA含量的檢測 收集待測細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作測定各組LDH水平。收集各組細(xì)胞，以適量0.125%胰蛋白酶加0.01% EDTA消化液消化細(xì)胞，超聲破碎。采用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，操作按照其試劑盒說明書進(jìn)行，吸光度值于550 nm波長處收集[10]。采用硫代巴比妥酸顯色法測定MDA含量，實驗按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，吸光度值于532 nm波長處收集[10]。根據(jù)吸光度值計算各組LDH、SOD活性及MDA含量。

3.6 MTT法檢測細(xì)胞活力 將待測細(xì)胞等量(1×104)接種于96孔板，按照實驗分組處理細(xì)胞后，每孔加入20 μL MTT (5 g/L)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入200 μL DMSO，搖床振搖10 min。將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀，于490 nm波長下測定各孔吸光度值?？瞻讓φ战M細(xì)胞活力視為100%，其余各組細(xì)胞活力以其占對照組的百分比表示[11]。

3.7 細(xì)胞凋亡的檢測 收集各組待測細(xì)胞，離心漂洗后，棄上清，按照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞。具體是以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，輕微搖晃至均勻，避光孵育10 min。依次加入適量Annexin V-FITC和PI，混勻，再次避光孵育10 min[12-13]。結(jié)束標(biāo)記后，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。其中，F(xiàn)ITC+/PI-象限代表凋亡早期細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI+象限代表壞死和凋亡晚期細(xì)胞，兩者之和代表細(xì)胞總凋亡。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究實驗均獨立重復(fù)進(jìn)行3次，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析的LSD-t法比較轉(zhuǎn)染實驗各組HUVECs中Sema 3A的表達(dá)水平。采用析因設(shè)計方差分析法比較各檢測實驗中各組HUVECs的相關(guān)指標(biāo)；Sema 3A單因素下多組間比較采用LSD-t檢驗；H2O2單因素下兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HUVECs中Sema 3A過表達(dá)效果的驗證

qPCR結(jié)果表明，Sema 3A的mRNA水平在Sema 3A-PCEP4轉(zhuǎn)染組中顯著高于empty-PCEP4轉(zhuǎn)染組和空白對照組(P<0.05)，同時Western blot檢測結(jié)果與qPCR結(jié)果相似，見圖1。本部分結(jié)果證明，HUVECs中Sema 3A過表達(dá)效果良好，滿足后續(xù)實驗要求。

Figure 1.The expression of Sema 3A in the HUVECs. A: the relative mRNA level of Sema 3A by qPCR; B: the relative protein level of Sema 3A detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsSema 3A-PCEP4 group.

圖1 Sema 3A在HUVECs中的表達(dá)

2 Sema 3A過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs炎性細(xì)胞因子水平的影響

H2O2處理HUVECs后，以qPCR法檢測炎性細(xì)胞因子mRNA水平的變化。TNF-α的mRNA水平在200 μmol/L H2O2處理的3組細(xì)胞中大幅度提高到至少3.7倍(P<0.05)，并在Sema 3A-PCEP4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中更為顯著，即與empty-PCEP4組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MCP-1、IL-1β及IL-6的mRNA水平也出現(xiàn)類似的變化，H2O2處理3組細(xì)胞后，MCP-1 的mRNA水平提高到至少1.8倍，IL-1β的mRNA水平提高到至少2.3倍，IL-6的mRNA水平大幅提高到至少4.1倍。此外，H2O2處理后，MCP-1、IL-1β及IL-6在Sema 3A-PCEP4組中的mRNA水平同樣顯著高于empty-PCEP4組(P<0.05)。單純Sema 3A過表達(dá)不影響HUVECs的炎性因子分泌，見圖2。以上結(jié)果表明，Sema 3A過表達(dá)依賴于H2O2，顯著加劇H2O2誘導(dǎo)的HUVECs中炎性因子的分泌。

Figure 2.qPCR was used to detect the mRNA levels of inflammatory cytokines TNF-α (A), MCP-1 (B), IL-1β (C) and IL-6 (D) in the HUVECs with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L H2O2；#P<0.05vsempty-PCEP4 (200 μmol/L H2O2).

圖2 HUVECs中炎性細(xì)胞因子mRNA水平的檢測

3 Sema 3A過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs生成LDH、SOD和MDA的影響

3組細(xì)胞組內(nèi)相比，H2O2處理后的HUVECs生成LDH和MDA的量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與empty-PCEP4組相比，Sema 3A過表達(dá)顯著加劇H2O2誘導(dǎo)的HUVECs中LDH活性、MDA含量及SOD活性的改變(P<0.05)，單純Sema 3A過表達(dá)不影響HUVECs的LDH活性、MDA含量及SOD活性，見圖3。

4 Sema 3A過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs活力的影響

對細(xì)胞活力的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)H2O2處理的3組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。經(jīng)200 μmol/L H2O2處理后，3組細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05)，并在Sema 3A-PCEP4組的細(xì)胞中更為明顯，即與empty-PCEP4組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，單純Sema 3A過表達(dá)不影響HUVECs的細(xì)胞活力，見圖4。該實驗結(jié)果表明，Sema 3A過表達(dá)顯著降低H2O2誘導(dǎo)的HUVECs活力。

5 Sema 3A過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

對細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)H2O2處理的3組細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。經(jīng)200 μmol/L H2O2處理后，3組細(xì)胞的凋亡率均顯著增加(P<0.05)，并在Sema 3A-PCEP4組細(xì)胞中更為突出，即與empty-PCEP4組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，單純Sema 3A過表達(dá)不影響HUVECs的細(xì)胞凋亡，見表2。類似變化趨勢也體現(xiàn)在促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)上，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)變化則相反，見圖5。以上結(jié)果表明，Sema 3A過表達(dá)顯著增強H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。

Figure 3.The changes of LDH (A), SOD (B) and MDA (C) levels in the HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L H2O2;#P<0.05vsempty-PCEP4 (200 μmol/L H2O2).

圖3 HUVECs中LDH、MDA及SOD指標(biāo)變化的檢測

Figure 4.The changes of the viability of the HUVECs with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L H2O2;#P<0.05vsempty-PCEP4 (200 μmol/L H2O2).

圖4 HUVECs活力的檢測

表2 HUVECs總凋亡率

Table 2.The total apoptosis rate of HUVECs (%. Mean±SD.n=3)

Group0μmol/LH2O2200μmol/LH2O2Blankcontrol4.65±0.459.63±0.78*Empty-PCEP44.72±0.498.95±0.75*Sema3A-PCEP44.46±0.4212.59±1.14*#

*P<0.05vs0 μmol/L H2O2；#P<0.05vsempty-PCEP4 (200 μmol/L H2O2).

討 論

AS是血管壁對各種損傷的異常反應(yīng)，其發(fā)病初期主要表現(xiàn)為急性滲出性炎癥，進(jìn)展期則表現(xiàn)出慢性增生性炎癥的特點[14]。目前，有關(guān)AS發(fā)病機(jī)制的學(xué)說有很多種，如脂質(zhì)浸潤學(xué)說、潴留應(yīng)答學(xué)說、血管平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說、Ca2+超負(fù)荷學(xué)說、血栓形成學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說及炎癥學(xué)說等[14]。

Figure 5.The expression of apoptosis-related proteins in the HUVECs with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L H2O2；#P<0.05vsempty-PCEP4 (200 μmol/L).

圖5 HUVECs中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

近年來，Sema 3A的免疫調(diào)節(jié)分子角色已被廣泛報道[15]，其參與了多種損傷性病理進(jìn)程，如大腦損傷[7]。然而，有關(guān)Sema 3A在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。氧化損傷是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的重要因素之一，本文以HUVECs為研究對象，探討了Sema 3A過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，HUVECs中Sema 3A過表達(dá)后，H2O2誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌繼續(xù)增加，LDH活性和MDA含量升高加劇，SOD活性下降增強，細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加，而未經(jīng)H2O2處理的HUVECs不受影響，表明Sema 3A能依賴于H2O2加劇H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷。

本文結(jié)果中Sema 3A對HUVECs損傷的促進(jìn)作用與其在其它損傷細(xì)胞中的研究結(jié)果相一致。例如，Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)Sema3A基因沉默的大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)出對低氧環(huán)境更強的對抗能力，體現(xiàn)在其對低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡的對抗作用上。Ranganathan 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Sema 3A在急性腎損傷小鼠及患者中表達(dá)上調(diào)，對小鼠中Sema 3A的遺傳性失活能夠保護(hù)缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷，體現(xiàn)在改善的組織病理學(xué)狀態(tài)，減少的炎性細(xì)胞侵潤及腎上皮細(xì)胞凋亡上。他們在體外研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Sema 3A能夠增強腎上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中由TLR4介導(dǎo)炎癥應(yīng)答；且未經(jīng)缺血再灌注處理的Sema 3A遺傳性失活小鼠和野生型小鼠炎性因子分泌水平并無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，這與本研究單純Sema 3A過表達(dá)對HUVECs沒有損傷效應(yīng)的結(jié)果類似。

目前關(guān)于Sema 3A在HUVECs中加強H2O2效應(yīng)的潛在機(jī)制，是我們即將研究的方向，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測可能與Sema 3A的免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)，即可能由H2O2誘發(fā)HUVECs產(chǎn)生免疫應(yīng)激后，再由Sema 3A介入?yún)⑴c免疫調(diào)節(jié)，進(jìn)而表現(xiàn)為細(xì)胞損傷效應(yīng)。HUVECs損傷需要經(jīng)外界條件誘導(dǎo)，本文結(jié)果表明Sema 3A不具有直接誘導(dǎo)其損傷的作用，而是需要借助于外界刺激因素H2O2來實現(xiàn)，這可能與H2O2刺激后HUVECs內(nèi)環(huán)境的改變有關(guān)，未來需要通過進(jìn)一步研究來做出解釋。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Sema 3A 過表達(dá)能夠加劇H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷，這一加劇過程具有H2O2依賴性，有關(guān)其發(fā)揮該作用的分子機(jī)制將在以后的研究中進(jìn)一步探究和揭示，以期為AS的防治提供新的研究思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Influences of semaphorin 3A over-expression on H2O2-induced injury in human umbilical vein endothelial cells

WANG Hai-fang1, ZHAO Xiang-rong1, HUO Xue-ping1, SUN Jing-ying1, WU Xiang-long2, NIU Yin-bo2, HU Jun1, LIU Qin-she3

(1LaboratoryCenterofShaanxiProvincePeople’sHospital,Xi’an710068,China;2SchoolofLifeSciences,NorthwesternPolytechnicalUniversity,Xi’an710072,China;3ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xi’an712046,China.E-mail:lqsspph@126.com)

AIM: To explore the influences of semaphorin 3A (Sema 3A) on hydrogen peroxide (H2O2)-induced injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS: Sema 3A over-expression vectors were constructed and transfected into the HUVECs by Lipofectamine 2000, and the over-expression effect was verified by qPCR and Western blot. The HUVECs in different groups were treated with or without 200 μmol/L H2O2for 4 h. The levels of inflammatory cytokines were measured by qPCR. The levels of lactic dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were detected by corresponding colorimetry. The cell viability was measured by MTT assay. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The levels of apoptosis-related proteins cleaved caspase-3 and Bcl-2 were determined by Western blot. RESULTS: H2O2induced inflammatory cytokine secretion, increased the levels of LDH and MDA, decreased SOD activity and cell viability, and increased cell apoptosis in the HUVECs. Over-expression of Sema 3A enhanced the above processes. No injury effect of Sema 3A over-expression on HUVECs without H2O2treatment was observed, indicating that the injury effects of Sema 3A on HUVECs depended on H2O2. CONCLUSION: Sema 3A markedly enhances H2O2-induced injury in the HUVECs, which depends on H2O2. Sema 3A may promote oxidative stress-caused endothelial cell injury.

Atherosclerosis; Semaphorin 3A; Hydrogen peroxide; Human umbilical vein endothelial cells

1000- 4718(2017)06- 1080- 06

2016- 09- 30

2017- 03- 28

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81573823)

R543.1+2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.020

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