北京規(guī)?；i場(chǎng)病毒性腹瀉隱性感染情況調(diào)查

劉 鄧 賈澤穎 張 丹 全炎銘 郭又春 劉莉如 劉修全 陳華林

（北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

北京規(guī)?；i場(chǎng)病毒性腹瀉隱性感染情況調(diào)查

劉 鄧 賈澤穎 張 丹 全炎銘 郭又春 劉莉如 劉修全 陳華林*

（北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

為了解PEDV、TGEV和RV在豬群中的隱性感染情況，對(duì)北京市8個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查。本次調(diào)查共采集到440份臨床健康糞樣，利用多重FQ-RT-PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：PEDV、RV、TGEV的陽(yáng)性率分明為14.1%、13.6%和3.2%；不同階段的豬群中，PEDV在保育-育肥階段陽(yáng)性率最高，達(dá)到25.4%；RV在仔豬階段陽(yáng)性率最高，達(dá)到27.3%；TGEV在保育-育肥階段陽(yáng)性率為8.5%。由此可知，規(guī)模化豬場(chǎng)PEDV、TGEV和RV隱性感染情況較為嚴(yán)重。

豬病毒性腹瀉；FQ-RT-PCR；隱性感染

豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus,RV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起規(guī)模化豬場(chǎng)豬群腹瀉的主要病原，一年四季均能發(fā)生，對(duì)仔豬的危害較為嚴(yán)重[1-2]。近幾年時(shí)有暴發(fā)，且波及面較廣，并呈現(xiàn)高發(fā)病率高死亡率的趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極為嚴(yán)重的損失[3-5]。據(jù)調(diào)查部分規(guī)?；i場(chǎng)在時(shí)間上呈現(xiàn)為波浪式暴發(fā)，為了解該情況出現(xiàn)的潛在因素，本研究采集北京市郊的8個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的440份臨床健康豬糞，進(jìn)行PEDV、TGEV和RV病原學(xué)方面的檢測(cè)，從而為豬病毒性腹瀉的防控提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

一步法熒光定量RT-PCR試劑盒，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自于Thermo Fisher公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)賀利氏儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品來(lái)源

采集自北京周邊某養(yǎng)殖公司下轄8個(gè)種豬場(chǎng)共440份臨床健康豬新鮮糞樣，其中：母豬（Ⅰ組）159頭份、保育-育肥豬（Ⅱ組）142頭份、仔豬（Ⅲ組）139頭份。

1.2.2 樣品前處理

從糞樣采集管中取出一定量的糞樣轉(zhuǎn)移進(jìn)1.5 mL離心管中，分別加入500 μL無(wú)菌生理鹽水，渦旋振蕩器上混勻，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中待檢。

1.2.3 RNA提取

按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。往1.5 mL離心管中加入560 μL AVL裂解液，隨后加入150 μL樣品渦旋混合15 s靜置10 min，瞬時(shí)離心后加入560 μL無(wú)水乙醇渦旋混合，轉(zhuǎn)移至收集管中，8 000 r/min離心1 min，棄掉廢液后收集管中加入500 μL AW1液體，8 000 r/min離心1 min，棄掉廢液后，收集管中加入500 μL AW2液體，14 000 r/min離心3 min，棄掉廢液后，14 000 r/min空離2 min，加入60 μL AVE，靜置1 min后，8 000 r/min離心1 min，做好標(biāo)記，-80℃凍存待用。

1.2.4 多重FQ-RT-PCR檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的多重FQ-RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV和RV三種病原，并設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)熒光定量PCR儀能夠收集到明顯的擴(kuò)增信號(hào)時(shí)則判定為陽(yáng)性（CT值＜35）；熒光信號(hào)增強(qiáng)不明顯（40＞CT值≥35）判定為可疑，需要復(fù)檢，復(fù)檢后如果40＞CT值≥35則判定為陽(yáng)性；無(wú)熒光信號(hào)增強(qiáng)則判為陰性，其具體的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件如下：2×One Step RT-PCR Buffer III 25μL，TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μL）1.5 μL，PrimeScript RT enzyme Mix II 1.0 μL，（PEDV/TGEV/RV）PCR Forward Primer（10 μM），（PEDV/TGEV/RV）PCR Reverse Primer （10 μM），（PEDV/TGEV/RV）Probe（10 μM），total RNA 10 μL，合計(jì)50μL。反應(yīng)條件：（反轉(zhuǎn)錄）42℃30min；（預(yù)變性）95℃30 s；95℃15 s；56℃30 s（退火延伸收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PEDV、TGEV、RV總體隱性感染狀況

采用多重FQ-RT-PCR方法對(duì)8個(gè)種豬場(chǎng)440份臨床健康豬糞進(jìn)行檢測(cè)，可疑樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，總體檢測(cè)結(jié)果如表1所示。2個(gè)種豬場(chǎng)PEDV、TGEV、RV陽(yáng)性率均為0；其余6個(gè)豬場(chǎng)以隱性感染PEDV和RV為主，PEDV陽(yáng)性率最高達(dá)到43.3%，RV陽(yáng)性率最高達(dá)到31.7%，整體上PEDV陽(yáng)性率為14.1%、RV為13.6%，而TGEV陽(yáng)性率只有3.2%。

2.2 不同階段豬群隱性感染情況

由表2知，不同日齡階段的豬群PEDV和RV均有隱性感染，TGEV在仔豬群沒(méi)有檢測(cè)到。PEDV隱性感染在保育-育肥階段陽(yáng)性率最高達(dá)到25.4%；RV隱性感染在仔豬階段陽(yáng)性率最高達(dá)到27.3%；TGEV隱性感染在各階段豬群均不高，保育-育肥階段陽(yáng)性率最高，為8.5%，仔豬階段感染率為0。

表1 8個(gè)種豬場(chǎng)3種病原隱性感染情況

表2 不同日齡豬群隱性感染情況

2.3 混合感染情況

本次抽樣調(diào)查的440份臨床健康糞樣中，PEDV和RV混合感染8份，混合感染率為1.8%；PEDV、RV和TGEV混合感染9份，混合感染率為2.0%。

3 結(jié)論

根據(jù)本次試驗(yàn)開(kāi)展的北京規(guī)?；i場(chǎng)病毒性腹瀉隱性感染情況調(diào)查可知，PEDV、TGEV和RV這三種較為常見(jiàn)的豬群腹瀉致病原中，隱性感染以PEDV為主（14.4%），其次為RV（13.6%），TGEV隱性感染率最低（3.2%），調(diào)查結(jié)果同近些年來(lái)國(guó)內(nèi)報(bào)道豬病毒性腹瀉發(fā)病感染情況基本一致。杜鵑等[6]采用多重RT-PCR方法，于2012—2013年間對(duì)北京部分區(qū)縣1 201份樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示：PEDV陽(yáng)性率4.66%，TGEV陽(yáng)性率2.58%，RV陽(yáng)性率6.16%。薛瑞雪等[7]采用RT-PCR方法對(duì)2013年10月至2014年10月采集的226份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：226份病料樣品中PEDV、TGEV和RV的陽(yáng)性率分別為34.96%、2.21%和28.76%，PEDV與RV的混合感染率為3.10%，表明PEDV和RV為山東仔豬腹瀉的主要病原，并存在多種病原混合感染情況。而本研究針對(duì)的主要是臨床健康豬群的流行病學(xué)調(diào)查，因此數(shù)據(jù)上看略高于其他文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)豬場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)情況分析，極有可能與部分豬場(chǎng)在調(diào)查前3—4個(gè)月有病毒性腹瀉暴發(fā)有關(guān)，因此在豬群發(fā)生病毒性腹瀉后，隱性感染情況會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)的一段時(shí)間。

本次調(diào)查中，不同階段的豬群其隱性感染情況也有較為明顯的區(qū)別，其中PEDV和RV在仔豬以及保育-育肥階段的隱性感染率較高，而TGEV在仔豬階段的隱性感染率為0，其他階段也有隱性感染，但較低，同國(guó)內(nèi)這方面的調(diào)查也基本相似。劉云波等[8]于2011—2012年間采用多重RT-PCR方法對(duì)13個(gè)省市的豬腹瀉以及臨床健康樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：臨床健康樣品中，保育-育肥豬PEDV、RV陽(yáng)性率分別為2.13%和1.42%，仔豬RV陽(yáng)性率達(dá)到12.86%，表明PEDV和RV存在有隱形感染情況。

本研究表明，規(guī)?；i場(chǎng)中PEDV、TGEV和RV的隱性感染情況較為突出，而且有研究表明目前病毒性腹瀉的暴發(fā)季節(jié)性越來(lái)越不明顯，田云等[9]在2012年通過(guò)對(duì)廣東省豬群流行性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)免疫率高、生物安全措施好的豬場(chǎng)發(fā)病率和死亡率均較低，因此病毒性腹瀉的防控應(yīng)以預(yù)防為主。

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[6]杜鵑,韋海濤,周德剛,等.北京地區(qū)豬主要病毒性腹瀉疾病的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2015,51(3):24-26.

[7]薛瑞雪,田野,田夫林,等.山東省部分地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,37(4):254-257.

[8]劉云波,趙洪翠,王志成,等.豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(2):204-207.

[9]田云,孫彥偉,王福廣,等.2012年廣東豬群腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2015,40(3):19-22.

S852.65

A

1673-4645(2017)04-0032-03

2017-01-18

劉鄧（1981-），男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事畜禽疫病診斷，E-mail：9465245@qq.com*

陳華林（1966-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜禽疫病防控