劉少鋒，汪慧慧，鄔克彬，熊興華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

甘藍(lán)型油菜GPDH基因克隆及其生物信息學(xué)分析

劉少鋒，汪慧慧，鄔克彬，熊興華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為了進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜GPDH基因，通過從擬南芥GPDH基因與甘藍(lán)型油菜的共線性分析發(fā)現(xiàn):擬南芥GPDH基因(At2g41540)在甘藍(lán)型油菜A基因組和C基因組中有4個(gè)拷貝，分別為：GSBRNA2T00132785001、GSBRNA2T00024258001、GSBRNA2T00058395001、GSBRNA2T00019118001。從GenBank分別下載了它們的DNA序列和cDNA序列，cDNA序列依次命名為GPDH1、GPDH2、GPDH3、GPDH4。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)了4對(duì)不同的引物，從甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)cDNA全長(zhǎng)序列中擴(kuò)增出了4條片段，分別命名為BnGPDH1、BnGPDH2、BnGPDH3、BnGPDH4。利用生物信息學(xué)軟件和在線系統(tǒng)進(jìn)行核苷酸序列分析和蛋白進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：4條片段大小依次為1 395，1 395，1 389，1 536 bp。其中，BnGPDH4翻譯成氨基酸時(shí)序列中間出現(xiàn)終止密碼子，不能合成有效蛋白。3個(gè)BnGPDH蛋白的氨基酸數(shù)目為464，464和462個(gè)，理論分子量為 51.584 4～51.829 7 kDa，二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例在42%左右，其次是延伸鏈所占比例約為15%。三者的跨膜結(jié)構(gòu)總體來說是相同的。3個(gè)蛋白都由保守結(jié)構(gòu)GpsA、NADB_Rossmann superfamily和NAD_Gly3P_dh_C superfamily組成，屬于GPDH超基因家族。同源建模分析表明3個(gè)蛋白均能適用甘油3磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)模型。對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在細(xì)胞質(zhì)膜的概率為79.0%。從序列分析、核苷酸聚類、理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、氨基酸聚類分析得出結(jié)論，它們具有GPDH基因家族的特征，為甘藍(lán)型油菜GPDH基因家族中的成員。

GPDH；甘藍(lán)型油菜；生物信息學(xué)分析

油菜是我國(guó)重要的油料作物，種植面積超過一億畝，提供了我國(guó)人民60%的食用油。通過改造和優(yōu)化油脂形成中關(guān)鍵酶的作用來提高油菜含油量，不但可以滿足人民對(duì)食用油日益增加的需求，而且可以運(yùn)用到潤(rùn)滑油、化妝品、化工原料、醫(yī)藥等領(lǐng)域。同時(shí)，菜籽油所含脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度與柴油酸相近，也是生產(chǎn)生物柴油的理想原料。由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益是不可估計(jì)的，對(duì)我國(guó)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。因此，高油油菜和油脂調(diào)控機(jī)理研究成為油菜研究的重要目標(biāo)[1]。甘油三磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)是糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮(DHAP)還原成3-磷酸甘油(G3P)和NAD+的酶[2]，3-磷酸甘油是油脂合成中的底物之一，其含量是油脂生成量的一個(gè)關(guān)鍵因素。也說明了GPDH是糖代謝連接脂代謝的關(guān)鍵酶，但對(duì)在油菜內(nèi)源GPDH基因的表達(dá)與種子含油量的關(guān)系不詳。因此，利用基因工程手段來克隆油菜GPDH基因，進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能，驗(yàn)證其對(duì)油菜種子含油量的影響具有重要意義。

伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)調(diào)控油脂合成過程中的關(guān)鍵酶的研究越來越深入，調(diào)控油脂合成過程的關(guān)鍵酶有很多，這些基因決定著油脂合成階段中間產(chǎn)物3-磷酸甘油、溶血磷脂酸、磷脂酸、二酰甘油、三酰甘油等的表達(dá)量，已經(jīng)有部分報(bào)道了這些酶對(duì)油脂的調(diào)控，如Yao等[3]將三角褐藻的GPDH基因在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)，細(xì)胞中甘油的濃度增加6.8倍，中性脂含量增加1.9倍，細(xì)胞干質(zhì)量增加39.7%。這說明GPDH基因在TAG合成中的重要作用。在工業(yè)上，通過缺失GUT2、NDE1、NDE2和FPSL切斷甘油降解途徑，大幅度促進(jìn)了甘油的生產(chǎn)，獲得高產(chǎn)甘油酵母菌株[4]。

對(duì)gpd1Δgpd2Δ雙缺陷型菌株，不能產(chǎn)生甘油，高度滲透壓敏感并不能在缺氧條件下生長(zhǎng)，伴隨著NADH的積累。超表達(dá)GPD1或GPD2基因，都會(huì)使該雙缺陷型在缺氧或高鹽條件下生長(zhǎng)。而且，GPD1和GPD2編碼的酶在一定培養(yǎng)條件可以相互代替[5]。另外還有報(bào)道植物細(xì)胞中3-磷酸甘油(G3P)是合成所有細(xì)胞甘油酯的重要組成，它是通過胞質(zhì)3-甘油磷酸脫氫酶或甘油激酶催化產(chǎn)生。提高G3P水平能提高植物抗病性抗病相關(guān)基因的表達(dá)[6-7]，還有研究表明，供給甘油或超表達(dá)NAD-GPDH能增加油菜G3P水平而促進(jìn)發(fā)育胚中TAG的合成[8]。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，表達(dá)胞質(zhì)中單基因編碼的ACCase并加上質(zhì)體定位序列，可使種子含油量增加5%[9]。在擬南芥和油菜中超表達(dá)酵母溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LAPT)含油量增加高達(dá)48%，田間試驗(yàn)也證明了有明顯提高[10]。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)催化TAG合成途徑即Kennedy途徑的最后一步，在野生型擬南芥中超表達(dá)擬南芥的二酰甘油轉(zhuǎn)移酶(DGAT)，其含油量得到增加[11]。過量表達(dá)擬南芥LEC1基因可影響其他轉(zhuǎn)錄因子，如ABI3、FUS3和WRI1等，提高脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的整體水平，引起脂肪酸和油脂含量的提高[12-13]。

綜合上述原因，進(jìn)一步研究GPDH的性質(zhì)和功能。通過擬南芥GPDH基因與油菜基因的共線性分析，找到油菜A、C基因組中位于胞質(zhì)的4個(gè)GPDH基因家族成員。查找GPDH基因的序列信息，設(shè)計(jì)引物，從性狀優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜雙低品種湘油15 cDNA中克隆出來4個(gè)不同的基因片段，并進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析討論。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2015-2016年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)樓作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)材料

油菜種質(zhì)：甘藍(lán)型油菜湘油15。由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄔賢夢(mèng)教授提供。

試劑及菌種：PGEM-TEasy Vector購自Promega公司。植物總RNA提取試劑盒TransZol UP、TransScriptTMFirst-Strand cDNASynthesis SuperMix試劑盒、DNA高保真聚合酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、大腸桿菌菌種DH5α、DNA凝膠回收試劑盒、微量質(zhì)粒提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成。測(cè)序工作由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1GPDH基因引物設(shè)計(jì) 登錄擬南芥數(shù)據(jù)庫，對(duì)擬南芥和甘藍(lán)型油菜共線性分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜GPDH基因有A基因組和C基因組，分別有2個(gè)不同的拷貝，分別為：GSBRNA2T00132785001、GSBRNA2T00024258001、GSBRNA2T00058395001、GSBRNA2T00019118001。依次簡(jiǎn)化名稱為GPDH1、GPDH2、GPDH3、GPDH4。用Primer5設(shè)計(jì)了4對(duì)不同的引物，如表1所示。引物交由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司合成。

表1 GPDH基因cDNA序列擴(kuò)增所需引物序列

1.3.2 湘油15號(hào)總RNA 的提取以及cDNA的合成 取處于開花期的湘油15號(hào)油菜花瓣50～100 mg，放置在預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮，充分而迅速研磨。按照TransZol UP試劑盒上的方法提取油菜花瓣總RNA，并通過凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)以及檢測(cè)總RNA濃度。以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系：Total RNA 5 μL，Anchored Oligo(dT)18 Primer 1 μL，2×TS Reaction Mix 15 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water 7 μL，總反應(yīng)體系30 μL。

1.3.3 目的基因克隆及測(cè)序 以合成的第一鏈cDNA為模板，合成的4對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，包括cDNA模板1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×Buffer 2 μL，5 U/μL HiFi高保真DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。用膠回收試劑盒回收目的基因，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將回收產(chǎn)物連接到PGEM-TEasy Vector。DNA連接反應(yīng)體系：Insert DNA 4 μL，PGEM-TEasy Vector 0.5 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL，2×Buffer 5 μL，總反應(yīng)體積10 μL。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選，12～16 h后可以觀察到藍(lán)色和白色的菌落。挑取白色的單菌落進(jìn)行菌落PCR，在檢測(cè)為陽性的菌落中挑取單菌落搖菌過夜，保存2管菌液，其中一管送上海生工生物科技有限公司測(cè)序，3次重復(fù)。剩余的菌液用于提取質(zhì)粒，再用凝膠電泳檢測(cè)提取的質(zhì)粒條帶，并保存至-20 ℃。

1.3.4 序列分析 基因序列同源性分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。作測(cè)序結(jié)果的初步鑒定，分析它們堿基序列差異。運(yùn)用MEGA 6.06進(jìn)行聚類系譜分析。

1.3.5 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 Primer Premier 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，經(jīng)BlastP進(jìn)一步鑒定。運(yùn)用ExPASY Protparam tool預(yù)測(cè)氨基酸的組成以及理化信息，疏水性分析，利用在線軟件GOR IV Secondary structure prediction method進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，利用在線軟件DAS預(yù)測(cè)可能的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，在NCBI上對(duì)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析，經(jīng)Swiss Model進(jìn)行同源建模分析，利用在線軟件PSORT Predition進(jìn)行編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3.6 多種植物氨基酸序列聚類分析 將BnGPDH1氨基酸序列作為參考序列，用NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP在線查找同源物種氨基酸序列，利用Mega 6.06把該基因氨基酸序列和多種植物氨基酸序列進(jìn)行聚類分析其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與分析

2.1.1GPDH基因在胞質(zhì)內(nèi)4個(gè)拷貝的獲得 設(shè)計(jì)4對(duì)不同的引物，從處于開花期的湘油15號(hào)油菜花瓣中提取總RNA，如圖1所示。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ，從cDNA中擴(kuò)增出4條大小不同的片段，片段大小1 400 bp左右，如圖2所示。將片段回收后克隆至PGEM-TEasy Vector，挑選陽性菌落PCR進(jìn)行檢測(cè)，獲得陽性重組子，測(cè)序?qū)Ρ鹊玫?個(gè)不同的序列，片段大小分別為1 395，1 395，1 389，1 536 bp。分別命名為BnGPDH1、BnGPDH2、BnGPDH3、BnGPDH4。

圖1 湘油15號(hào)總RNA電泳圖譜

2.1.2GPDH基因鑒定 克隆得到的4個(gè)基因序列在網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.mih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行分析，BnGPDH1與甘藍(lán)型油菜GPDH1全長(zhǎng)CDS相似度為92%，序列覆蓋度為100%，BnGPDH2與甘藍(lán)型油菜GPDH2全長(zhǎng)CDS相似度為92%，序列覆蓋度為100%，BnGPDH3與甘藍(lán)型油菜GPDH3全長(zhǎng)CDS相似度為99%，序列覆蓋度為99%，BnGPDH4與甘藍(lán)型油菜GPDH4全長(zhǎng)CDS相似度為99%，序列覆蓋度為93%。利用Lasergene7.0分別對(duì)GPDH1和BnGPDH1、GPDH2和BnGPDH2、GPDH3和BnGPDH3、GMPDH4和BnGPDH4進(jìn)行相似性評(píng)估，如表2所示。綜合表明：BnGPDH1與GPDH1相似度達(dá)99.6%，BnGPDH2與GPDH2相似度99.9%，BnGPDH3與GPDH3相似度99.1%，BnGPDH4與GPDH4相似度99.9%。Mega 6.06對(duì)上述基因比對(duì)分析結(jié)果，如圖3所示。上述結(jié)果初步表明，根據(jù)NCBI下載的cDNA序列設(shè)計(jì)的引物，以湘油15號(hào)油菜cDNA為模板擴(kuò)增所得的4條CDS序列初步鑒定為油菜胞質(zhì)內(nèi)GPDH基因A基因組和C基因組的4個(gè)不同拷貝。

M.DGL2000 DNA Marker。

表2 基因間相似性分布表

由Mega 6.06軟件繪制，圖中數(shù)值表示自展值。This analysis was generated by using Mega 6.06 program，the number means Bootstrap value.

2.2 四個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

2.2.1 四個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 用Primer premier 5.0軟件將GPDH基因4個(gè)拷貝的序列分別翻譯為氨基酸序列，使用在線軟件ExPASY Protparam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)GPDH家族基因理化性質(zhì)，如表3所示。從表3中可以得知，3個(gè)BnGPDH蛋白的氨基酸數(shù)目分別為464，464和462個(gè)，理論分子量為 51.584 4～51.829 7 kDa，所編碼的氨基酸偏向于中性蛋白，且編碼的是穩(wěn)定蛋白，均具有較高的脂肪族特性，同時(shí)屬于親水性蛋白。BnGPDH4在翻譯成氨基酸序列時(shí)，中間存在終止密碼子，不能形成有效蛋白，故之后不做具體結(jié)構(gòu)分析。

表3 甘藍(lán)型油菜GPDH家族基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.2 三個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 利用在線軟件GOR IV Secondary structure prediction method(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析工具，分別對(duì)3個(gè)基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果如表4、圖4所示。從中可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)BnGPDH 蛋白的α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例在42%左右，其次是延伸鏈所占比例約15%。

2.2.3 三個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析 利用在線軟件DAS(http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)預(yù)測(cè)蛋白可能存在的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，結(jié)果如表5所示。從中可以發(fā)現(xiàn)BnGPDH1與BnGPDH2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域是完全一致的，與BnGPDH3的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)只有一個(gè)氨基酸的差別。三者的跨膜結(jié)構(gòu)總體來說是相同的。

2.2.4 三個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對(duì)BnGPDH1、BnGPDH2和BnGPDH3進(jìn)行Blast分析其保守結(jié)構(gòu)域，分析結(jié)果如圖5所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)蛋白都由保守結(jié)構(gòu)GpsA、NADB_Rossmann superfamily和NAD_Gly3P_dh_C superfamily組成，屬于GPDH超基因家族。

表4 甘藍(lán)型油菜GPDH家族基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

A.BnGPDH1；B.BnGPDH2；C.BnGPDH3。圖5同。A.BnGPDH1;B.BnGPDH2;C.BnGPDH3. The same as

表5 甘藍(lán)型油菜GPDH家族基因編碼蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

Tab.5 Analysis of transmembrane region of proteins encoded byGPDHfamily genes inBrassicanapus

蛋白Protein編號(hào)No.N末端Nterminal跨膜區(qū)TransmembraneregionC末端Cterminal長(zhǎng)度/bpLengthBnGPDH1/BnGP-DH2152GAWGSVFAA6092191PVIISL19663292IGAGMV29764382VG3832BnGPDH3150GAWGSVFAA5892189PIIISL19463290IGAGMV29564380VG3812

圖5 甘藍(lán)型油菜GPDH蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

2.2.5 三個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH基因編碼蛋白同源建模分析 經(jīng)Swiss Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)同源建模分析，發(fā)現(xiàn)BnGPDH1、BnGPDH2、BnGPDH3均能適應(yīng)甘油3磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosp-hate dehydrogenase)模型。進(jìn)一步說明3個(gè)基因是GPDH家族中的成員，模型如圖6所示。

圖6 GPDH基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 三個(gè)甘藍(lán)型油菜GPDH蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用在線軟件PSORT Predition(http://psort.hgc.jp/form.html)對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，3個(gè)蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果是一致的，該蛋白最有可能定位在細(xì)胞質(zhì)膜，可能性高達(dá)79.0%，其次是微體(過氧化物酶)和高爾基體可能性30.0%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜可能性20.0%。

2.4 多種植物GPDH氨基酸序列分析比對(duì)

將BnGPDH1氨基酸序列作為參考序列，用NCBI數(shù)據(jù)庫BlastP在線查找同源物種氨基酸序列，利用Mega 6.06把BnGPDH1、BnGPDH2、BnGPDH3的氨基酸序列與擬南芥(BAH20028.1)、木薯(OAY43223.1)、可可(XP_007028708.1)、蒺藜苜蓿(XP_003625105.2)、 桃樹(XP_007202031.1)、木豆(KYP51998.1)、金錢橘(XP_006421155.1)、楊樹(XP_002308924.1)、 菠菜(KNA11457.1)、木本棉(KHG04169.1)、赤豆(KOM34172.1)、 菜豆(XP_007162159.1)、蓖麻(EEF49622.1)、巨桉(KCW90121.1)、高粱(XP_002456915.1)的氨基酸序列進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖7所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，從左至右第4個(gè)節(jié)點(diǎn)處可以將聚類圖分為5個(gè)大類，第Ⅰ類由甘藍(lán)型油菜和木豆、菜豆、赤豆、蒺藜苜蓿、菠菜、擬南芥組成，第Ⅱ類由桃樹、金錢橘、可可、木本棉組成，第Ⅲ類由木薯、楊樹組成，第Ⅳ類僅巨桉，第Ⅴ類由蓖麻、高粱組成。甘藍(lán)型油菜GPDH基因家族與擬南芥親緣關(guān)系非常近，其次和菠菜、木豆、菜豆、赤豆、蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系較近。

圖7 多種植物已報(bào)道GPDH氨基酸聚類圖

3 討論與結(jié)論

研究植物脂肪合成中關(guān)鍵酶的作用對(duì)利用基因工程手段提高油菜含油量具有重要意義。劉野[14]從酵母中克隆GPD1和從擬南芥中克隆DGAT構(gòu)建了種子特異表達(dá)載體；弭憲杰等[15]從蓖麻中克隆RcGPDH基因，功能分析表明RcGPDH基因可能對(duì)蓖麻種子油脂合成沒有顯著的作用，由此推測(cè)，蓖麻種子中可能還存在一個(gè)與AtGPDH基因高度同源的基因參與蓖麻TAG的合成。胡軍[16]利用同源基因克隆法獲得了甘藍(lán)型油菜2個(gè)GPDH基因，擬南芥表達(dá)系在種子重量、種子含油量同非陽性對(duì)照比較無明顯差異，增強(qiáng)了植物抗鹽脅迫能力。張超[17]采用同源克隆法在甘藍(lán)型油菜中克隆到了2個(gè)拷貝，基因組織表達(dá)分析顯示BnG3PDH在種子油分積累高峰期高表達(dá)，在角果皮中表達(dá)量很低；高、低含油量材料中基因表達(dá)分析結(jié)果顯示在油分積累關(guān)鍵時(shí)期BnG3PDH在高油材料種子的表達(dá)量要明顯高于低含油量材料種子中基因的表達(dá)量。

2014年8月22日在科學(xué)雜志上公布甘藍(lán)型油菜基因測(cè)序完成[18]，為從基因組角度探討油菜基因的協(xié)調(diào)進(jìn)化規(guī)律及其對(duì)性狀形成的影響以及多倍體優(yōu)勢(shì)形成機(jī)制提供了契機(jī)。以往對(duì)油菜基因的研究是采用同源克隆法，只研究了少數(shù)拷貝基因的表達(dá)情況且基因的染色體組定位也不清楚。作者首次通過擬南芥GPDH基因與油菜基因的共線性分析，找到油菜A、C基因組中位于胞質(zhì)的4個(gè)GPDH基因家族成員。從性狀優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜雙低品種湘油15號(hào)cDNA中克隆出來的4個(gè)不同的基因片段，并進(jìn)行了測(cè)序。利用軟件比對(duì)，對(duì)應(yīng)序列的相似度達(dá)99.1%以上，初步證明了所克隆片段BnGPDH1 、BnGPDH2、BnGPDH3、BnGPDH4是甘藍(lán)型油菜GPDH基因家族的成員，當(dāng)進(jìn)一步分析其氨基酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)BnGPDH4核酸序列翻譯成氨基酸序列時(shí)，序列中出現(xiàn)了終止密碼子，由此推測(cè)BnGPDH4是GPDH基因家族成員，但是并不能合成GPDH蛋白，所以BnGPDH4不再做進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

在擬南芥中存在分別以FAD和NAD為輔酶的兩類3-磷酸甘油脫氫酶[2，19]一類以FAD為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶(FAD-GPDH；EC1.199.5)是定位在線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，另一類是以NAD為輔酶的3-磷酸甘油脫氫酶(NAD-GPDH，EC1.1.1.8)是定位在胞質(zhì)和質(zhì)體，這和本次研究中甘藍(lán)型油菜GPDH基因家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位在胞質(zhì)中的結(jié)論是相吻合的。

對(duì)這3個(gè)基因編碼的蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，其編碼的蛋白是中性蛋白，這與GPDH蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的偏中性環(huán)境相吻合[20]。對(duì)其進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析可以看出都具有GpsA、NADB_Rossmann superfamily和NAD_Gly3P_dh_C superfamily保守結(jié)構(gòu)域，這與其他對(duì)GPDH基因保守結(jié)構(gòu)域的報(bào)道是一致的[21]。核苷酸聚類分析和氨基酸聚類分析都可以發(fā)現(xiàn)，來自A基因組的BnGPDH1和來自C基因組的BnGPDH2親緣關(guān)系更近，在編碼蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)也有相同的結(jié)論。

利用RT-PCR從甘藍(lán)型油菜湘油15中克隆GPDH基因家族位于細(xì)胞質(zhì)中A基因組和C基因組的4個(gè)CDS分別命名為BnGPDH1、BnGPDH2、BnGPDH3、BnGPDH4，經(jīng)過生物信息學(xué)分析鑒定，它們具有GPDH基因家族的特征，為甘藍(lán)型油菜GPDH基因家族中的成員。

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Cloning and Bioinformatics Analysis ofGPDHin Rapeseed

LIU Shaofeng，WANG Huihui，WU Kebin，XIONG Xinghua

(Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

To further study onGPDHofBrassicanapus，through the collinearity analysis of theGPDHfromArabidopsisthalianaandBrassicanapus:there are 4 copies ofGPDHof A genome and C genome in theBrassicanapuscalled as GSBRNA2T00132785001，GSBRNA2T00024258001，GSBRNA2T00058395001，GSBRN-A2T00019118001.Four cDNA were downloaded from GenBank,are named as：GPDH1，GPDH2，GPDH3 andGPDH4.Four pairs of primers were designed according to the sequence informations，and four nucleotide fragments were amplified from Xiangyou 15 full-length cDNA，designated asBnGPDH1，BnGPDH2，BnGPDH3，BnGPDH4.The result of nucleotide sequences and protein structure analysis by bioinformatics software and online system showed:Four CDS sequences length were 1 395，1 395，1 389，1 536 bp respectively.WhenBnGPDH4 is translated into the amino acid sequence，we found a stop codon in the middle ofBnGPDH4.Which isn′t an active protein.The number of amino acid of three other BnGPDH are 464，464 and 462 respectively.Secondary structure are consistant of the alpha helix(42%)，random coil(42%)and extended chain(15%).The transmembrane structure of the three proteins was uniform.Their conservative domains consist of GpsA，NADB_Rossmann superfamily and NAD_Gly3P_dh_C superfamily，which belong to theGPDHsuperfamily.Homology modeling analysis showed that they were of model of Glycerol-3-phosphate dehydrogenase and located in cytoplasm by subcellular localization analysis.In terms of sequence composition，phylogenic tree，physico-chemical property，secondary structure and tertiary structure and subcellular localization，they have the characteristics ofGPDHsuperfamily.They should be the members ofGPDHsuperfamily.

GPDH；BrassicanapusL.；Bioinformatics analysis

2017-01-11

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB150200)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ1006-3)

劉少鋒(1990-)，男，湖南婁底人，在讀碩士，主要從事油菜分子生物學(xué)研究。

熊興華(1967-)，男，湖南安鄉(xiāng)人，副研究員，博士，主要從事油菜分子生物學(xué)及基因工程研究。

Q78；S635.03

A

1000-7091(2017)02-0109-08

10.7668/hbnxb.2017.02.017