關(guān) 皎，朱鶴云，李海鵬，董 穎，郝乘儀，王黎明，馮 波

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林132013; 2.寧夏回族自治區(qū)藥品審評認證中心寧夏銀川750001)

回流法與閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的工藝對比研究

關(guān) 皎1，朱鶴云1，李海鵬1，董 穎2，郝乘儀1，王黎明1，馮 波1

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林132013; 2.寧夏回族自治區(qū)藥品審評認證中心寧夏銀川750001)

為了對比研究回流提取法與閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的工藝，采用超快速液相色譜法測定澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量，回流法和閃式提取法均以乙醇濃度、提取時間、料液比為考察因素，以澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量為考察指標，采用 L9(34) 正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝。結(jié)果回流提取法的最佳提取工藝：提取溶劑為95%乙醇，提取時間為2 h，料液比為1∶50；閃式提取法的最佳提取工藝：提取溶劑為95%乙醇，提取時間為1 min，料液比為1∶60。表明閃式提取法所得澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量高于回流提取法。閃式提取法的操作簡單、耗時短、提取率高、節(jié)省能源，可為澤瀉藥材的新藥開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，同時為新獸藥開發(fā)利用提供參考。

澤瀉 ； 23-乙酰澤瀉醇B ； 超快速液相色譜法 ； 閃式提取法 ； 回流提取法

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam.) Juzep.的干燥塊莖。性寒、味甘、歸腎、膀胱經(jīng)、具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效，可用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛、高脂血癥等[1]。主產(chǎn)于福建、四川等地。澤瀉主要含有三萜、二萜類、倍半萜成分[2-4]。現(xiàn)代藥理研究表明，澤瀉具有抑制腎結(jié)石形成、降血壓、抗動脈粥樣硬化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性[5-7]。23-乙酰澤瀉醇B為澤瀉中的主要二萜類活性成分，中國藥典2015版將其用于澤瀉藥材鑒別和含量測定[1]。目前，文獻報道的澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取方法多為回流提取法[8-13]和超聲法[11-13]。本研究將一種新的提取方法-閃式提取法應(yīng)用于提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B提取的工藝參數(shù)，并將其與回流法進行比較，為更加深入的研究澤瀉藥材的質(zhì)量標準和新藥開發(fā)提供試驗依據(jù)，有利于將澤瀉的藥用價值充分應(yīng)用于獸藥行業(yè)，為天然藥物應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域提供參考。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC型超快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG16KR臺式高速冷凍離心機(長沙東旺實驗儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀有限公司)。

乙腈為色譜純(美國Fisher科技)，所用水為經(jīng)過Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對照品23-乙酰澤瀉醇B(批號：111846-201504)，購自中國食品藥品檢定研究院，純度大于98 %。

澤瀉藥材，購自吉林市吉林大藥房(鹽澤瀉)，產(chǎn)地四川，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室李景華副教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juzep.的干燥塊莖，樣本留存于吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院中藥樣品室。

2 方法與結(jié)果

2.1 23-乙酰澤瀉醇B的含量測定。

2.1.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)；流動相為乙腈-水(80∶20)；流速為0.4 mL/min；檢測波長為208 nm；柱溫為30 °C；進樣量5 μL ，色譜圖見圖1。

2.1.2 標準曲線的制備 精密稱取對照品澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B適量，用乙腈配成濃度為 0.1 mg/mL 對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0 mL，置于5 mL量瓶中，用乙腈-水(80∶20)定容至刻度，依次注入超快速液相色譜儀，測定色譜峰面積，以樣品色譜峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，23-乙酰澤瀉醇B的回歸方程為：Y= 2.195×104X+9.30×103,R= 0.9999 結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B濃度在2-40 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗 分別精密吸取“2.1.2”項下制備的第3個對照品溶液5 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD(n=6)為0.3%，表明儀器精密度良好。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，測定峰面積。結(jié)果RSD為1.7%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一批澤瀉樣品6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，計算23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果RSD為2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 回收率試驗 精密稱取已知含量(23-乙酰澤瀉醇B含量分別為0.074 %)的澤瀉樣品粉末9份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入相當于樣品中23-乙酰澤瀉醇B含有量的80%，100%，120%的對照品溶液適量，各3份。按“2.1.7”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的平均回收率為98.9 %。

2.1.7 供試品的測定 取澤瀉藥材粉末(過40目篩)約0.5g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入乙腈25mL，稱定重量，超聲(250 W，40 kHz)提取30 min，放冷后再稱重，用乙腈補足減失的重量，搖勻、濾過。精密量取續(xù)濾液4mL，蒸干，殘渣用乙腈-水(80∶20)4 mL溶解后轉(zhuǎn)移至離心管中，搖勻，離心，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行 HPLC 分析。

2.2 回流提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B

2.2.1 正交試驗設(shè)計 以單因素試驗結(jié)果為參考，選擇乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)3個因素，以澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量為考察指標，采用L9(34)正交設(shè)計表安排試驗，因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 回流法因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知，以23-乙酰澤瀉醇含量(%)為檢測指標，各因素影響順序為 A>C>B，乙醇濃度對提取工藝有較大的影響。優(yōu)化出回流法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B最佳方案為A3B3C2，即提取溶劑為95%乙醇，提取時間為2 h，料液比為1∶50。

2.2.2 驗證試驗 取供試品3份，按照優(yōu)化工藝條件，重復(fù)3次試驗進行驗證，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的含量(%)平均為0.143%，比正交試驗中最高提取率(0.108%)高，表明試驗所確定的工藝條件為回流法最佳工藝條件。

2.3 閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B

2.3.1 正交試驗設(shè)計 以單因素試驗結(jié)果為參考，選擇乙醇濃度(B)、提取時間(C)、料液比(D)3個因素，以澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量為考察指標，采用L9(34)正交設(shè)計表安排試驗，因素水平見表4，正交試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 閃式提取法因素水平

表5 正交試驗結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

由表6可知，以23-乙酰澤瀉醇含量(%)為檢測指標，各因素影響順序為 C>B>A，料液比對提取工藝有較大的影響。優(yōu)化出回流法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B最佳方案為 A3B1C3，即提取溶劑為95%乙醇，提取時間為1 min，料液比為1∶60。

2.3.2 驗證試驗 取供試品3份，按照優(yōu)化工藝條件，重復(fù)3次試驗進行驗證，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的含量(%)平均為 0.309%，比正交試驗中最高提取率(0.247%)高，表明試驗所確定的工藝條件為回流法最佳工藝條件。

2.4 回流法與閃式提取法提取效果對比 以不同方法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的條件及含量對比見表7。由表7可知，閃式提取法提取時間僅為回流法的 1/120，并且含量比回流的含量高，因而閃式提取法更加省時、高效。

表7 閃式提取與回流提取結(jié)果比較

3 討論

閃式提取器是根據(jù)組織破碎原理科學(xué)設(shè)計而成的一種新型提取器，對含不同類型化學(xué)成分的中草藥進行了研究，取得了較好的效果。閃式提取器的原理可總結(jié)為：快速破碎、超速動態(tài)分子滲透作用、劇烈攪拌、強力振動作用。閃式提取法有省時、省力、操作簡單等優(yōu)點可為澤瀉藥材中有效成分的提取工藝研究提供新的方法。目前已有很多文獻對回流法和超聲法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取工藝進行比較[11-13]，但對于閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取工藝的研究較少。本研究把閃式提取法應(yīng)用于澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取工藝中，以澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量為指標，并對回流提取法和閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取工藝進行比較，得出的最佳提取工藝為閃式提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B：提取溶劑為 95%乙醇，提取時間為 1 min，料液比為 1∶60。結(jié)果表明，閃式提取法比回流提取法提取澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的提取率更高，且操作簡單，提取時間短，具有明顯的優(yōu)勢。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2015 年版一部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 229.

[2] 胡雪艷，陳海霞，高文遠，等. 澤瀉化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥，2008, 39 (12): 1788-1790.

[3] 肖飛艷，馮育林，楊世林，等. 澤瀉化學(xué)成分的研究進展[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2009, 20 (5): 491-495.

[4] 許文，羅奮熔，趙萬里，等. 澤瀉降糖活性提取物化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2014, 45 (22): 3238-3245.

[5] 李淑子，金在久，張善玉. 澤瀉不同提取物對高脂血癥小鼠血脂及脂質(zhì)過氧化的影響[J]. 中國實用醫(yī)藥，2008, 3(32): 7-9.

[6] 張朝鳳，周愛存，張勉，等. 澤瀉的化學(xué)成分及其免疫抑制活性篩選[J]. 中國新藥雜志，2009, 34(8): 994-998.

[7] 劉妙娜，賀戰(zhàn)梅，張立冬，等. 澤瀉防治泌尿系結(jié)石有效部位提取工藝研究[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(10):1329-1331.

[8] 王建平，傅旭春，白海波. 澤瀉降血尿酸乙醇提取物的提取工藝研究[J]. 中國中藥雜志，2010, 14(35): 1809-1811.

[9] 許鋒，彭松，尹強，等. 正交試驗法優(yōu)選人參和澤瀉的混合提取工藝研究[J]. 湖北中醫(yī)雜志，2007, 29(5): 49-50.

[10] 周本杰，莫軒輝. 澤瀉降脂有效部位提取工藝的篩選研究[J]. 中國藥房，2006, 17(2): 103-105.

[11] 楊鋒，趙漢臣，閆薈，等. 23-乙酰澤瀉醇B 4種提取方法比較[J]. 中國藥房，2007, 18(6): 429-430.

[12] 鄧迎娜，易醒，肖小年，等. 超聲提取澤瀉中三萜類總組分[J]. 食品工業(yè)科技，2007, 28(9):145-147.

[13] 何舒瀾. 澤瀉中澤瀉醇B-23乙酸酯兩種提取工藝的比較與優(yōu)化[J]. 海峽藥學(xué)，2009, 21(3):24-25.

Comparison of reflux and smashing tissue extraction process of Alisol B-23-acetate fromAlismatisRhizoma

GUAN Jiao1, ZHU He-yun1, LI Hai-peng1, DONG Ying2, HAO Cheng-yi1，WANG Li-ming1, FENG Bo1

(1.School of Pharmacy , Jilin Medical University , Jilin 132013 ，China；2.Center for certification & Evaluation of Ning Xia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750001,China)

To compare the reflux extraction process and smashing tissue extraction process of Alisol B-23-acetate inAlismatisRhizoma. Alisol B-23-acetate was determined by an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method.The best extraction technology was optimized by L9(34) orthogonal experimental design with ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio as factors and with the content of Alisol B-23-acetateasindex. The optimal Reflux Extraction process was as follows: extraction solvent of 95% ethanol, extraction time of 2 h, and material-liquid ratio of 1∶50. The optimal smashing tissue extraction process was as follows: extraction solvent of 95% ethanol, extraction time of 1 h, and material-liquid ratio of 1∶60.The content of Alisol B-23-acetate inAlismatisRhizomaby Smashing tissue extraction was higher than that in Reflux Extraction. The Smashing tissue extraction was simple, short time with high extraction rate and less energy, Which could provide the basis for the new drug development and industrial production ofAlismatisRhizoma.

AlismatisRhizoma; Alisol B-23-acetate; UFLC; Smashing tissue extraction process; Reflux extraction process

FENG Bo

2016-12-02

吉林省衛(wèi)生廳科研課題(2013Z008)；吉林省中醫(yī)藥管理局科研課題(2015Z726)

關(guān)皎(1983-)，女，講師，博士，研究方向為中藥質(zhì)量控制及藥代動力學(xué)，Email：rainbowguanjiao@sina.com

馮波，E-mail：fengbo2@sina.com

R284.2

A

0529-6005 (2017)04-0095-04