杜燕華，李懿，馬宏，王海峰，許汴利，黃學(xué)勇

2014—2016年河南省鼠類(lèi)攜帶漢坦病毒的病原學(xué)分析

杜燕華，李懿，馬宏，王海峰，許汴利，黃學(xué)勇△

目的分析河南省鼠類(lèi)攜帶漢坦病毒的基因型別和病原學(xué)特點(diǎn)。方法選取2014—2016在駐馬店市確山縣捕獲的600只鼠類(lèi)標(biāo)本，分析該地區(qū)野外和居住區(qū)優(yōu)勢(shì)鼠種和鼠密度。采用RT-PCR法擴(kuò)增鼠肺標(biāo)本中漢坦病毒的特異性片段（M和S片段），以M片段（2 003～2 302 nt）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分析基因亞型和進(jìn)化特點(diǎn)。結(jié)果確山縣野外優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠和黑線姬鼠，鼠密度在1.33%～1.83%；居住區(qū)優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠、小家鼠和黃胸鼠，鼠密度1.36%～1.97%。RT-PCR結(jié)果顯示2014年3只鼠攜帶漢坦病毒，鼠種分別為小家鼠、大倉(cāng)鼠和褐家鼠。3株病毒M片段和S片段核苷酸同源性均為100%，基于M片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示屬于S4亞型漢城型漢坦病毒，與韓國(guó)和我國(guó)湖北省分離的病毒親緣關(guān)系較近。結(jié)論河南省確山縣鼠類(lèi)攜帶的漢坦病毒為S4亞型，宿主范圍廣泛，有必要采取相關(guān)防控措施，預(yù)防腎綜合征出血熱的流行。

腎綜合征出血熱；漢坦病毒；基因型；河南；病原學(xué)；系統(tǒng)進(jìn)化分析

腎綜合征出血熱是由漢坦病毒引起的、以嚙齒類(lèi)動(dòng)物為主要傳染源的一種自然疫源性疾病。該病分布廣泛，已成為世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)是受腎綜合征出血熱危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，目前31個(gè)省、市、自治區(qū)均有病例報(bào)告，發(fā)病人數(shù)占世界報(bào)道病例的90%以上［1-2］。20世紀(jì)八、九十年代，河南省曾是我國(guó)出血熱的重發(fā)病省份，近年來(lái)隨著人們生活水平和衛(wèi)生意識(shí)的提高，河南省的發(fā)病人數(shù)大幅下降。為了進(jìn)一步了解河南省出血熱的宿主動(dòng)物的病毒攜帶情況和病原特征，筆者對(duì)2014—2016年腎綜合征出血熱國(guó)家級(jí)監(jiān)測(cè)點(diǎn)駐馬店市確山縣的鼠肺組織進(jìn)行了核酸檢測(cè)和序列分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及試劑 2014—2016年春季和秋季，按照《全國(guó)腎綜合征出血熱監(jiān)測(cè)方案》，在國(guó)家級(jí)監(jiān)測(cè)點(diǎn)河南省駐馬店市確山縣的野外和居住區(qū)用鼠籠捕獲老鼠，計(jì)算鼠密度并對(duì)鼠種進(jìn)行分類(lèi)鑒定，無(wú)菌解剖取鼠肺組織，放于液氮罐中保藏。全自動(dòng)核酸提取儀及相關(guān)試劑盒購(gòu)自西安天隆科技有限公司，組織研磨器（MM200型）購(gòu)自德國(guó)RETSCH公司，一步法RT-PCR試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。鼠密度（%）=捕鼠只數(shù)/布夾數(shù)。

1.2 鼠肺組織研磨和RNA提取 每只鼠肺組織取50～100 mg，置于加有5 mm直徑鋼珠，500 μL生理鹽水的離心管中，在組織研磨器中震蕩研磨（800 Hz，3 min）后，10 000 r/min 離心5 min。取上清200 μL，按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取核酸 100 μL，-70℃保存。

1.3 漢坦病毒核酸檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［3］，委托上海生工生物工程有限公司合成擴(kuò)增漢坦病毒的2對(duì)引物：S片段上游5′-ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG-3′，下 游 5′-GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度 450 bp；M片段上 游 5′-AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGGG-3′，下游 5′-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度 463 bp。一步法反應(yīng)體系如下：5×OneStep RT-PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix（含 10 mmol/L of each dNTP）2 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，RNA 模板 5 μL;OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，滅菌水補(bǔ)足至 50 μL。RT-PCR 條件：50 ℃30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。獲得陽(yáng)性漢坦病毒S和M片段擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建 將測(cè)序結(jié)果用DNAstar進(jìn)行拼接，上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。利用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，Bioedit軟件將漢坦病毒的M片段進(jìn)行剪切。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載其他地區(qū)分離的漢坦病毒序列后進(jìn)行同源性分析，最后采用MEGA 5.0軟件用鄰位相連法（Neighbor-joining Method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析采用1 000個(gè)多序列組（replicates）。

2 結(jié)果

2.1 確山縣宿主動(dòng)物監(jiān)測(cè)結(jié)果 2014—2016年確山縣共捕鼠600只。其中，野外優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠和黑線姬鼠，鼠密度在1.33%～1.83%；居住區(qū)優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠、小家鼠和黃胸鼠，鼠密度1.36%～1.97%，見(jiàn)表 1。

2.2 鼠肺標(biāo)本的核酸檢測(cè)和序列測(cè)定 核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，3只鼠肺漢坦病毒M和S片段擴(kuò)增均為陽(yáng)性，均為2014年秋季捕獲，其中居住區(qū)2只，野外1只。將擴(kuò)增的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)，為漢城型漢坦病毒（SEOV），將序列信息上傳NCBI，獲得GenBank登錄號(hào)，見(jiàn)表2。

Tab.1 Specie information of monitored rats in Qushan county,2014-2016表1 2014—2016年確山縣鼠種監(jiān)測(cè)情況

Tab.2 Information of rat samples with Hantann virus in Queshan country,2014表2 2014年確山縣攜帶漢坦病毒的鼠標(biāo)本信息

2.3 核酸序列同源性比較 此次測(cè)定的3份鼠肺標(biāo)本所攜帶的漢坦病毒，M片段和S片段之間的核苷酸同源性均為100%。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載12株S1～S5五個(gè)基因亞型的漢城型病毒（GenBank登錄號(hào)分別為 AF035832/S1、AF288652/S1、AB027087/S2、 AB027088/S3、 AF190119/S3、 DQ159911/S3、S47716/S4、AB027521/S5、AB027083/S1、AF035833/S1、S72343/S4、AB027086/S2），基于此次擴(kuò)增的部分M片段進(jìn)行核酸序列比較，發(fā)現(xiàn)與S4亞型的同源性最高，核苷酸同源性分別在95.9%～96.6%；與其他亞型的M片段同源性在85.5%～95.9%。

2.4 基于M片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析 用M片段G2區(qū)（2 003～2 302 nt）以 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示，此次測(cè)定的3個(gè)鼠肺標(biāo)本所攜帶的漢坦病毒均屬于漢城型S4基因亞型，與湖北和韓國(guó)的毒株親緣關(guān)系較近，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Phylogenetic trees based on M partial sequences(G2 region)of M segment(2 003-2 302 nt)圖1 基于M片段G2區(qū)（2 003～2 302 nt）的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

河南省曾是我國(guó)出血熱的重發(fā)病省份，1981年曾暴發(fā)過(guò)家鼠型出血熱疫情，我國(guó)第1株漢坦病毒也分離于此地［4-5］。由于大力開(kāi)展有效的疾病防控，以及人民整體生活水平和衛(wèi)生意識(shí)的提高，河南省的發(fā)病人數(shù)大幅下降；然而一些老的疫源地如確山縣，宿主動(dòng)物持續(xù)攜帶漢坦病毒，使該地區(qū)發(fā)病具有明顯的時(shí)間和空間聚集性［6-7］。盡管近年來(lái)不斷有新的漢坦病毒被發(fā)現(xiàn)，但我國(guó)目前流行的漢坦病毒仍然主要是漢灘型和漢城型［8-9］。既往研究認(rèn)為，河南省疫區(qū)主要為家鼠型疫區(qū)，攜帶的病毒血清型為漢城型［10］。本次研究通過(guò)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，河南省的主要流行型別仍為漢城型，2014年—2016年野外優(yōu)勢(shì)鼠種主要為褐家鼠，本次發(fā)現(xiàn)野外攜帶病毒的鼠種也為褐家鼠。居民區(qū)的優(yōu)勢(shì)鼠種每年有所不同，有褐家鼠、小家鼠和黃胸鼠［10］。本次發(fā)現(xiàn)居民區(qū)攜帶病毒的鼠種是小家鼠和大倉(cāng)鼠。

漢坦病毒培養(yǎng)困難，傳統(tǒng)的空斑減少中和實(shí)驗(yàn)常用于病毒分型，但時(shí)間周期長(zhǎng)，技術(shù)難度高，生物安全等級(jí)也高，目前已逐漸被基因分型方法所取代。1994年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)已對(duì)漢坦病毒基因組分型制定了標(biāo)準(zhǔn)：新的漢坦病毒至少有1個(gè)基因片段的核苷酸序列和其他已知序列的差異小于75%；漢坦病毒亞型，至少有1個(gè)基因片段的核苷酸序列和該型的其他病毒序列有5%～24%的差異；同一亞型，所有基因片段的核苷酸序列差異在5%以下。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型研究發(fā)現(xiàn)，基于M片段 G2 區(qū)（2 003～2 302 nt）構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，基因分型與血清分型結(jié)果一致，因而常用來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和分型研究［11-12］。2002年，河南省曾進(jìn)行過(guò)漢城型病毒基因亞型和分布的研究，發(fā)現(xiàn)河南省主要以S1和S3亞型為優(yōu)勢(shì)型別，而確山縣均為S3亞型［10］。本次研究發(fā)現(xiàn)，確山縣的優(yōu)勢(shì)亞型已變?yōu)镾4亞型，與其相鄰的湖北省流行的S4亞型同源性最高，可能與周邊省份流行型別的進(jìn)化與傳播有關(guān)，且此次研究發(fā)現(xiàn)的S4亞型漢城型病毒在小家鼠、大倉(cāng)鼠和褐家鼠3個(gè)鼠種中均有發(fā)現(xiàn)，宿主范圍廣泛，可能會(huì)造成疫源地的擴(kuò)大，因而有必要采取加強(qiáng)病原監(jiān)測(cè)、防鼠滅鼠、健康教育等綜合性防控措施，從而有效地預(yù)防河南省腎綜合征出血熱的流行。

［1］Zhang YZ，Holmes EC.What is the time-scale of hantavirus evolution?［J］.Infect Genet Evol，2014，25：144-145.doi：10.1016/j.meegid.2014.04.017.

［2］馬超鋒，余鵬博，李恒新，等.中國(guó)腎綜合征出血熱流行現(xiàn)狀及免疫策略［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2014，48（12）：1039-1042.Ma CF，Yu PB，Li HX，et al.The present situation and immune strategy of hemorrhagic fever with renal syndrome in China［J］.Chin J Prev Med，2014，48（12）：1039-1042.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.12.004.

［3］Ibrahim SM，Aitichou M，Hardick J，et al.Detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever，Hanta，and sandfly fever viruses by realtime RT-PCR［J］.Methods Mol Biol，2011，665：357-368.doi：10.1007/978-1-60761-817-1_19.

［4］白雪帆，王平忠.腎綜合征出血熱和漢坦病毒肺綜合征研究進(jìn)展［J］.中國(guó)病毒病雜志，2011，4：241-245.Bai XF，Wang PZ.Hantavirus pulmonary syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome［J］.Chinese Journal of Viral Diseases，2011，4：241-245.

［5］Jonsson CB，F(xiàn)igueiredo LT，Vapalahti O.A global perspective on hantavirus ecology，epidemiology，and disease［J］.Clin Microbiol Rev，2010，23（2）：412-441.doi：10.1128/CMR.00062-09.

［6］王海峰，聶軼飛，李孟磊，等.集中度結(jié)合圓形分布分析河南省2005—2010年腎綜合征出血熱季節(jié)特征［J］.中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2012，23（4）：345-346.Wang HF，Nie YF，Li ML，et al.Analysis on the seasonal characteristics of hemorrhagic fever with renal syndrome from 2005 to 2010 in Henan province by concentration ratio and circular distribution［J］.Chin J Vector Biol＆Control，2012，23（4）：345-346.

［7］郭秀花，曹務(wù)春，胡良平，等．聚類(lèi)分析對(duì)中國(guó)腎綜合征出血熱疫區(qū)分型的探討［J］．中華流行病學(xué)雜志，2003，24（7）：45-48.Guo XH，Cao WC，Hu LP，et al.Typing of hemorrhagic fever with renal syndrome by cluster analysis［J］.Chin J Epidemiol，2003，24（7）：45-48.doi：10.3760/j.issn：0254-6450.2003.07.012.

［8］Wang H，Yoshimatsu K，Ebihara H，et al.Genetic diversity of hantaviruses isolated in China and characterization of novel hantaviruses isolated from Niviventer confucianus and Rattus rattus［J］.Virology，2000，278（2）：332-345.

［9］張海林，張?jiān)浦?中國(guó)漢坦病毒基因型及分布［J］.中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2011，21（5）：417-420.Zhang HL，Zhang YZ.Distribution and gene-typing of Hantaviruses in China［J］.Chin J Vector Biol＆Control，2011，21（5）：417-420.

［10］孫黎，張永振，李林紅，等.河南省Ⅱ型漢坦病毒基因亞型及其分布的研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2005，26（8）：578-582.Sun L,Zhang YZ,Li LH,et al.Genetic subtypes and distribution of seonl virus in Henan［J］.Chin J Epidemiol，2005，26（8）：578-582.doi：10.3760/j.issn：0254-6450.2005.08.008.

［11］HolmesEC，ZhangYZ.Theevolution and emergenceof hantaviruses［J］.Curr Opin Virol，2015，10：27-33.doi：10.1016/j.coviro.2014.12.007.

［12］王世文，杭長(zhǎng)壽，王華，等.我國(guó)漢坦病毒基因型和基因亞型的分布研究［J］.病毒學(xué)報(bào)，2002，18（9）：211-216.Wang SW，Hang CS，Wang H，et al.Genotype and clade distribution of hantaviruses in China［J］.Chinese Journal of Virology，2002，18（9）：211-216.doi：10.3321/j.issn：1000-8721.2002.03.004.

（2017-04-08收稿 2017-04-28修回）

（本文編輯 胡小寧）

Pathogenic analysis of rat infected hantavirus in Henan province,2014-2016

DU Yan-hua,LI Yi,MA Hong,WANG Hai-feng,XU Bian-li,HUANG Xue-yong△
Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Henan Key Laboratory of Pathogenic Organism,Zhengzhou 450016,China△

E-mail:hxyzzu@163.com

ObjectiveTo analyze the genotyping of hantavirus and investigate the pathogenic features of local rats in Henan province.MethodsA total of 600 rats captured in Queshan county,Zhumadian city from 2014-2016 were chosen to find out the major species and density.Rat lung specimens were detected by RT-PCR using partial M and S segment primers,then sequencing and phylogenetic analysis based on M segment(2 003-2 302 nt)were performed to analyze gene subtype and evolution.ResultsIn the field of Queshan county,major species were sewer rats and apodemus agrarius,and the average density of rats was 1.33%-1.83%.Sewer rats,mus musculus and apodemus agrarius were major species in the residential area,and the average density of rats was 1.36%-1.97%.Hantaviruses were detected by RT-PCR in three captured rats in 2014,and the species were mus musculus,cricetulus triton and sewer rats.Nucleotide homology similarity based M and S segment of three positive products was 100%.Phylogenetic analysis indicated the virus was belonged to S4 subgenotype of Seoul virus,which was similar with the strains in Korea and Hubei province,China.ConclusionThe virus from rats in Queshan county,Henan province is seoul virus,S4 subgenotype.It is necessary to take the relevant prevention and control measures to prevent hemorrhagic fever of renal syndrome because of wide host range.

hemorrhagic fever with renal syndrome;Hantann virus;genotype;Henan;etiology;phylogenetic analysis

R373.32

：A

10.11958/20170418

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573204）；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃（164100510008）

鄭州，河南省疾病預(yù)防控制中心，河南省傳染病病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編450016）

杜燕華（1981），女，碩士，副主任技師，主要從事傳染病預(yù)防控制方面研究

△通訊作者 E-mail:hxyzzu@163.com