劉吉祥++吉沐祥++芮東明++楊勇++陳宏州+楊敬輝

摘要：為篩選防治葡萄炭疽病的高效低毒新型復(fù)配藥劑，降低有效用藥量，提高防治效果，防止與延緩抗藥性的產(chǎn)生，采用菌絲生長速率法測定吡唑醚菌酯、戊唑醇及其復(fù)配制劑對葡萄炭疽病病菌的毒力，并通過田間試驗評價它們對葡萄炭疽病的防治效果。結(jié)果表明：吡唑醚菌酯、戊唑醇及其質(zhì)量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5復(fù)配組合對葡萄炭疽病病菌的半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別為1.038 8、0.358 3、0.612 9、0.530 1、0.232 6、0.232 8、0.329 6 μg/mL；5種復(fù)配組合對葡萄炭疽病病菌的增效系數(shù)（SR）分別為1.29、1.33、2.29、1.84、1.22，其中以1 ∶1復(fù)配組合的增效作用最大。田間防效調(diào)查結(jié)果表明，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑1 000、2 000、3 000倍液及430 g/L戊唑醇懸浮劑5 000倍液、250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液對葡萄炭疽病防治效果分別為91.54%、90.80%、82.88%、76.43%、7410%，防治效果排序為25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑（簡稱復(fù)配劑）高濃度>復(fù)配劑中濃度>復(fù)配劑低濃度>430 g/L戊唑醇懸浮劑5 000倍液 >250 g/L 吡唑醚菌酯乳油2 000倍液。因此，吡唑醚菌酯、戊唑醇復(fù)配防治葡萄炭疽病增效明顯，其中以質(zhì)量比1 ∶1混合后對葡萄炭疽病增效作用最明顯，果穗套袋前采用25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑1 000～2 000 倍液浸果防治葡萄炭疽病病害防效均達90%以上。

關(guān)鍵詞：葡萄炭疽病；吡唑醚菌酯；戊唑醇；復(fù)配；抑制活性；田間防效

中圖分類號： S436.631.1+5文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0087-04

葡萄炭疽病別稱晚腐病，主要是由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的[1-2]。在所有葡萄病害中，葡萄炭疽病是葡萄生產(chǎn)上最流行的，也是最重要的病害之一[3]，該病主要危害著色期或近成熟期的果實，果實發(fā)病后造成果粒變褐、軟腐、易脫落，或形成僵果，不僅造成減產(chǎn)，而且嚴(yán)重影響果實的品質(zhì)。葡萄炭疽病在我國各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，尤其在我國南方葡萄產(chǎn)區(qū)，由于夏季高溫高濕，更容易暴發(fā)葡萄炭疽病。一般情況下，該病造成葡萄產(chǎn)量損失可達5%以上，如遇潮濕、多雨年份易造成大流行，病穗率達50%～70%[4]，對我國葡萄產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重影響。目前生產(chǎn)上對葡萄炭疽病的防治方法主要以化學(xué)手段為主，常用農(nóng)藥主要是有機硫類和芳香類殺菌劑代森錳鋅、福美雙、百菌清等，以及苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、甲基硫菌靈等。近年來，甾醇脫甲基抑制劑（DMI）類殺菌劑咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑[5-6]等以及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯等[7-8]也開始在該病害防治上得以應(yīng)用。但是由于藥劑的長期以及不合理使用，代森錳鋅、福美雙、多菌靈[9]乃至一些新型殺菌劑等均已產(chǎn)生了一定的抗藥性，導(dǎo)致藥劑對葡萄炭疽病的田間防效大幅下降[10-11]，有些藥劑使用后的副作用問題、藥害問題、污染問題明顯[12]，已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，不能保證葡萄生產(chǎn)的正常進行，篩選效率高、殺菌譜廣、對環(huán)境友好的殺菌劑并提供合理安全的用藥技術(shù)已經(jīng)是葡萄生產(chǎn)中的迫切需求[13-14]。

藥劑混合使用是植物病原菌抗藥性治理對策之一[15]。合理混用可以擴大防治譜，提高防治效果，降低防治成本。目前已經(jīng)明確，在多數(shù)情況下，2種不同作用機制的殺菌劑混合使用可在一定程度上延緩或阻止病原菌種群對殺菌劑的抗性發(fā)展[15-16]。吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其抑菌機制是作用于真菌線粒體呼吸鏈中的細胞色素bc1復(fù)合物，阻止電子傳遞，進而抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長，為新型高效廣譜殺菌劑[17]。戊唑醇是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性強的三唑類殺菌劑，具有低毒安全、高效廣譜等特性，主要通過抑制病原真菌體內(nèi)甾醇的脫甲基化，導(dǎo)致生物膜的形成受阻而發(fā)揮殺菌活性，屬于甾醇脫甲基化抑制劑，對作物具有持久保護、治療作用[18]。吡唑醚菌酯與戊唑醇作用機制各異，2種藥劑混配既具有保護作用又具有治療作用，或許有利于克服或延緩葡萄炭疽病病菌抗藥性的發(fā)展，從而提高防治效果。為了進一步明確吡唑醚菌酯、戊唑醇混合物對葡萄炭疽病病菌是否具有增效作用，本試驗進行了吡唑醚菌酯、戊唑醇的混合物聯(lián)合毒力測定，并通過田間藥效試驗評價2種藥劑混用對葡萄炭疽病的防治效果及產(chǎn)量的影響，旨在明確吡唑醚菌酯、戊唑醇復(fù)配對葡萄炭疽病病菌的毒力及最佳配比，以期為有效防治葡萄炭疽病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗時間與地點

本試驗于2014年4—7月在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實驗室進行。

1.2供試菌株

葡萄炭疽病病菌（Glomerella cingulata），采自江蘇省句容市華陽鎮(zhèn)葡萄園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室分離、鑒定、保存?zhèn)溆?。菌株保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）斜面上（4 ℃）。

1.3供試藥劑

96%吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）原藥，由江蘇耘農(nóng)化工有限公司提供；95%戊唑醇（tebuconazole）原藥，由鹽城利民農(nóng)化有限公司提供。

1.4儀器設(shè)備

主要儀器與設(shè)備：電子天平（精確度0.1 mg）、GZP-300A培養(yǎng)箱（南京恒裕電子儀器廠）、直徑為75 mm的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。

1.5室內(nèi)抑菌活性測定

1.5.1藥液的配制及濃度設(shè)計（1）母液配制：將96%吡唑醚菌酯原藥、95%戊唑醇原藥用適量丙酮溶解后加10%吐溫80，配制成1 000 μg/mL母液，置于4 ℃冰箱中備用。

（2）各藥劑單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計：吡唑醚菌酯在含藥PSA培養(yǎng)基中的濃度設(shè)計為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL；戊唑醇在含藥PSA培養(yǎng)基中的濃度設(shè)計為3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75、0.046 88 μg/mL；吡唑醚菌酯·戊唑醇（復(fù)配質(zhì)量比例5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5）復(fù)配劑在含藥PSA中的濃度設(shè)計均為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 13 μg/mL。單劑、復(fù)配劑的設(shè)計均為7個不同濃度梯度含藥PSA培養(yǎng)基。

除母液外，所有試驗藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2試驗方法采用菌絲生長速率法[19]測定藥劑的抑制作用，將各單劑與復(fù)配劑的藥液依次稀釋至所需濃度，然后將1 mL藥液與9 mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，制成含系列濃度藥劑的PSA培養(yǎng)基，采用無菌水作空白對照，各處理重復(fù)4次。將保留的葡萄炭疽病病菌轉(zhuǎn)接到PSA平皿中，在25 ℃下活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到含藥的PSA平皿、空白對照平皿中。25 ℃培養(yǎng)96 h，待對照中菌落長至約平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率：菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。取抑制率在5%～95%范圍的數(shù)據(jù)，采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算藥劑對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限。

1.5.3聯(lián)合作用評價方法根據(jù)Wadley法[19]，計算增效系數(shù)（SR）。根據(jù)增效系數(shù)（SR）評價藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。相關(guān)公式如下：

式中：A、B為殺菌劑單劑；a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，%；EC50（th）為混劑EC50理論值；EC50（ob）為混劑EC50實測值。

1.6田間防效試驗

1.6.1試驗點概況田間試驗于2014年在鎮(zhèn)江萬山紅遍農(nóng)業(yè)園進行。葡萄品種為夏黑，樹齡4年，栽培方式為籬架，栽培管理水平良好，當(dāng)季內(nèi)未使用其他相關(guān)藥劑。

1.6.2試驗設(shè)計將吡唑醚菌酯、戊唑醇按質(zhì)量比1 ∶1的比例加工成為25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑。試驗設(shè)25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所配制）1 000、2 000、3 000倍液（以下分別簡稱高濃度、中濃度、低濃度）和250 g/L吡唑醚菌酯乳油（巴斯夫歐洲公司）2 000倍液、430 g/L戊唑醇懸浮劑（鹽城利民農(nóng)化有限公司）5 000倍液、清水對照6個處理，每個處理重復(fù)3次，隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)供試葡萄樹3株。

1.6.3統(tǒng)計方法果粒直徑為1 cm時浸果處理，1 h后馬上套袋，果實成熟后摘袋調(diào)查病果率。每個處理取10個果穗，調(diào)查并計錄總果粒數(shù)、病果粒數(shù)，計算病果率及防治效果。

葡萄炭疽病以病果率表示各處理區(qū)的發(fā)病情況，相關(guān)公式如下：

病果率=病果數(shù)/調(diào)查總果數(shù)×100%；

防治效果=（對照區(qū)病果率-處理區(qū)病果率）/對照區(qū)病果率×100%。

2結(jié)果與分析

2.1室內(nèi)抑菌活性測定研究

2.1.1吡唑醚菌酯、戊唑醇對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制作用從表1看出，當(dāng)吡唑醚菌酯的濃度為0.156 25～10 μg/mL 時，對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制率為 22.03%～85.32%；當(dāng)戊唑醇處理濃度為0.046 88～3 μg/mL時，對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制率為19.75%～82.53%。結(jié)果表明，2種殺菌劑對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制活性以及對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的最低抑制濃度（MIC值）有差異。

2.1.2吡唑醚菌酯與戊唑醇復(fù)配對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制作用從表2看出，吡唑醚菌酯與戊唑醇復(fù)配組合不同處理濃度對炭疽病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；吡唑醚菌酯與戊唑醇5種復(fù)配組合的濃度為0.078 13～5 μg/mL時，5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5配比的組合對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制率分別為16.46%～81.01%、21.02%～81.27%、29.88%～96.46%、31.65%～96.96%、23.05%～95.19%。

2.1.3吡唑醚菌酯、戊唑醇對葡萄炭疽病病菌的毒力測定和復(fù)配聯(lián)合作用類型2種單劑、5種復(fù)配組合對葡萄炭疽病病菌的作用模型見表3，可以看出，濃度對數(shù)與防治效果（抑制率）的相關(guān)系數(shù)均≥0.993 2，說明防治效果（抑制率）的變異有99.32%或以上來自濃度對數(shù)的變異，表明用所得模型表

達濃度對數(shù)與防治效果（抑制率）的關(guān)系可行。

由表3還可見，吡唑醚菌酯、戊唑醇單劑對葡萄炭疽病病菌的EC50分別為1.038 8、0.358 3 μg/mL，戊唑醇對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制活性高于吡唑醚菌酯；吡唑醚菌酯與戊唑醇分別以質(zhì)量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5復(fù)配后對葡萄炭疽病病菌菌絲生長抑制的EC50分別為0.612 9、0.530 1、0.232 6、0.232 8、0.329 6 μg/mL，并且吡唑醚菌酯與戊唑醇分別以質(zhì)量比1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5復(fù)配后對炭疽病病菌的抑制作用均強于單劑；5種復(fù)配組合對葡萄炭疽病病菌的增效系數(shù)（SR）分別為1.29、1.33、2.29、1.84、1.22，其中質(zhì)量比為 1 ∶1 時增效作用明顯。根據(jù)Wadley的評價法，吡唑醚菌酯與戊唑醇分別以質(zhì)量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶5復(fù)配，增效系數(shù)（SR）在0.5～1.5之間，表現(xiàn)出相加作用；以質(zhì)量比1 ∶1、1 ∶3 復(fù)配，增效系數(shù)分別為2.29、1.84，增效系數(shù)（SR）>1.5，表現(xiàn)出增效作用，其中以質(zhì)量比1 ∶1復(fù)配的增效系數(shù)（SR）最高，為2.29。因此，從整體上判斷吡唑醚菌酯、戊唑醇的復(fù)配劑對葡萄炭疽病病菌的抑制作用較好，并且推薦最佳復(fù)配質(zhì)量比為1 ∶1。

2.2田間防治效果試驗

為了進一步驗證25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑對葡萄炭疽病的防治效果，特別進行了田間防治效果試驗。從藥后50 d采摘前調(diào)查結(jié)果（表4）可以看出，對于葡萄炭疽病防治效果，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑1 000、2 000倍液極顯著高于2個單劑，顯著高于25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑 3 000 倍液，而25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑3 000倍液又明顯高于2個單劑，其中25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑高濃度防效最高，為91.54%，均高于其他各處理，其次為中濃度防效，為90.80%，高于低濃度和各單劑，低濃度防效為8288%，高于430 g/L戊唑醇懸浮劑5 000倍液、250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液，后二者防效分別為 76.43%、7410%，對照區(qū)發(fā)病果粒率僅為9.46%；從防治效果來看，基本排序為25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑（簡稱復(fù)配劑）高濃度>復(fù)配劑中濃度>復(fù)配劑低濃度>430 g/L戊唑醇懸浮劑5 000倍液>250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液。由此可見，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑防治葡萄炭疽病病害的建議濃度為1 000～2 000倍液。

3討論與結(jié)論

炭疽病是全世界葡萄種植國家和地區(qū)廣泛分布的一種重要病害， 它嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量、質(zhì)量。目前，生產(chǎn)上防治

該病害常用的藥劑有苯并咪唑類的甲基硫菌靈、多菌靈、甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）的咪鮮胺、戊唑醇等。由于使用頻繁，部分藥劑已產(chǎn)生抗性，防效較差。李洋對遼寧省葡萄炭疽病病菌對多菌靈敏感性測定顯示，某些地區(qū)已產(chǎn)生了抗藥性較強的菌株[9]。吡唑醚菌酯、戊唑醇作為新型廣譜殺菌劑，在炭疽病防治上已有報道[20]。目前，還沒有關(guān)于葡萄炭疽病病菌對吡唑醚菌酯產(chǎn)生抗藥性的報道，但吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，作用位點單一，主要抑制病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長所需能量的產(chǎn)生，屬“高抗性風(fēng)險”藥劑[21]，長期使用容易產(chǎn)生抗藥性。葉佳等研究表明，浙江省葡萄炭疽病病菌對DMIs類殺菌劑戊唑醇的抗藥性發(fā)展迅速[22]。關(guān)于吡唑醚菌酯、戊唑醇復(fù)配劑對葡萄炭疽病的防治尚未見報道，吡唑醚菌酯、戊唑醇的復(fù)配可以在防治炭疽病上提供一種新的選擇，避免長期單一大量使用同一種藥劑加速葡萄炭疽病病菌抗藥性的產(chǎn)生。

本研究采用室內(nèi)毒力測定與田間藥效試驗相結(jié)合的方法，測試了吡唑醚菌酯、戊唑醇及其復(fù)配劑對葡萄炭疽病的防治效果。結(jié)果表明：通過室內(nèi)毒力測定，吡唑醚菌酯、戊唑醇對葡萄炭疽病病菌均具有較好的抑菌活性，其中戊唑醇對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制活性又高于吡唑醚菌酯。在單劑毒力的基礎(chǔ)上，結(jié)合不同殺菌劑的作用機制，選擇甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯分別與三唑類殺菌劑進行不同配比的毒力測定。結(jié)果表明，其中有2個配比（1 ∶1、1 ∶3）表現(xiàn)為增效作用，其中吡唑醚菌酯、戊唑醇以質(zhì)量比1 ∶1混合后對葡萄炭疽病病菌菌絲生長的抑制活性最高，增效作用最明顯；其他配比均表現(xiàn)出相加作用。吡唑醚菌酯為最新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有很強的滲透性及局部內(nèi)吸活性，而戊唑醇內(nèi)吸性強，可以抑制病菌的再侵染，二者作用機制不同，復(fù)配后增效明顯。本試驗篩選出了具有明顯增效作用的混劑，為葡萄炭疽病的田間防治奠定了基礎(chǔ)。筆者將篩選出的新型混劑進行了田間小區(qū)試驗，將吡唑醚菌酯和戊唑醇按質(zhì)量比1 ∶1制成25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮液，結(jié)果表明，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑1 000～2 000倍液對葡萄炭疽病的防效達到90%以上，效果最好，可在葡萄田間推廣應(yīng)用。室內(nèi)毒力測定與田間藥效試驗結(jié)果基本相符，室內(nèi)抑菌效果較好的復(fù)配劑組合在田間防效最高，其防效均在82%以上，明顯優(yōu)于對照藥劑430 g/L戊唑醇懸浮劑、250 g/L吡唑醚菌酯乳油。在田間試驗過程中，該藥劑在試驗濃度條件下對葡萄樹安全，無藥害發(fā)生。因此，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇懸浮劑有望成為將來生產(chǎn)上防控葡萄炭疽病的首選藥劑。

綜合以上分析表明，吡唑醚菌酯、戊唑醇復(fù)配防治葡萄炭疽病可行，研究結(jié)果為生產(chǎn)中農(nóng)藥復(fù)配提供了試驗依據(jù)，從而為葡萄病害的防治提供了新思路和新方法，具有較好的應(yīng)用前景，但關(guān)于其抗藥性等方面還有待進一步研究。

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