張運峰

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玉米大斑病菌與融合基因載體的構建及其在畢赤酵母中的表達

張運峰

唐山師范學院生命科學系，河北唐山 063000

張運峰. 玉米大斑病菌STK1與EGFP融合基因載體的構建及其在畢赤酵母中的表達. 生物工程學報, 2017, 33(6): 986–994.Zhang YF. Construction of Setosphaeria turcica STK1-EGFP fusion gene vector and its expression in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 986–994.

基因是玉米大斑病菌調(diào)控分生孢子發(fā)育、滲透脅迫調(diào)節(jié)和致病性的重要MAPK基因。本文首先構建了含有增強型綠色熒光蛋白基因 () 的畢赤酵母GSS115 (GS115) 表達載體pPIC3.5K-EGFP，再以玉米大班病菌模式菌株01-23的菌絲cDNA為模板，PCR擴增基因，克隆到pPIC3.5K-EGFP，構建了融合基因的GS115表達載體pPIC3.5K-STK1-EGFP。利用電擊轉化法將該融合基因表達載體轉化到GS115感受態(tài)細胞內(nèi)，利用MD培養(yǎng)基篩選、PCR鑒定，獲得了融合基因的畢赤酵母轉化子。通過RT-PCR和熒光觀察，發(fā)現(xiàn)基因和基因均可以高效穩(wěn)定地表達。另外，在試驗中我們還發(fā)現(xiàn)，在基因起始密碼子前加入Kozak序列可以使融合基因的表達強度增強4.8倍。以上研究結果為基因表達蛋白的亞細胞功能定位和抗體制備奠定了基礎。

玉米大斑病菌，融合基因，畢赤酵母，基因表達

玉米大斑病菌是玉米上一種重要的病原真菌，由其引起的玉米大斑病是玉米上的重要葉部病害，在流行年份常造成50%的減產(chǎn)損失[1]。植物病原真菌促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK) 信號途徑是重要的信號途徑，主要參與調(diào)控植物病原真菌的生長、發(fā)育及致病性等[2-4]?；蚴怯衩状蟀卟【幸粋€重要的MAPK基因，前期研究表明該基因主要參與調(diào)控玉米大斑病菌分生孢子的發(fā)育、滲透脅迫調(diào)節(jié)、分生孢子萌發(fā)、附著胞產(chǎn)生和致病性等[5]。畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種成熟的蛋白表達系統(tǒng)，表達蛋白能夠正確折疊并行使功能[6]。

基因是玉米大斑病菌MAPK信號傳導途徑中的關鍵基因[7]，但對于研究STK1蛋白的結構及細胞內(nèi)功能定位目前尚無報道。本實驗通過構建適于畢赤酵母GS115中穩(wěn)定、高效表達融合基因的甲醇誘導型表達載體，為進一步制備STK1蛋白結晶體及其抗體、明確STK1蛋白的功能定位奠定基礎。

1 材料

1.1 菌株和質粒

菌株：畢赤酵母GS115 (GS115) 和玉米大斑病菌模式菌株01-23由河北農(nóng)業(yè)大學董金皋教授惠贈。

質粒：酵母表達載體pPIC3.5K和增強型綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-N1由南開大學生化與分子生物學實驗室惠贈。

1.2 試劑

TMDNA聚合酶、Pyrobest高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、酵母基因組DNA提取試劑盒等購自TaKaRa公司；真菌總RNA快速抽提試劑盒、M-MuLV逆轉錄酶，YNB、生物素、甘油、甲醇和無水乙醇等試劑均購自BBI公司。

PCR擴增和等基因的引物由BBI公司合成 (表1)。

2 方法

2.1 玉米大斑病菌基因cDNA的克隆

玉米大斑病菌模式菌株01-23的總RNA提取和第一條鏈的合成參照王梅娟等[8]的試驗方法進行，然后以獲得的cDNA為模板，分別利用引物對STK1-F1/STK1-R和STK1-F2/STK1-R擴增在起始密碼子前不含有Kozak序列的基因 (STK1-A) 和在起始密碼子前含有Kozak 序列的基因 (STK1-B)。PCR擴增體系：cDNA模板50 ng，10×緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，引物(10 μmol/L) 各2 μL，TMDNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化擴增片段。

2.2 畢赤酵母表達載體的構建

以pEGFP-N1質粒為模板，利用引物EGFP-F和EGFP-R擴增基因，用RⅠ和Ⅰ雙酶切后利用DNA連接酶將EGFP克隆入載體pPIC3.5K，構建基因載體pPIC3.5K-EGFP。將基因和pPIC3.5K- EGFP同時進行RⅠ和Ⅰ雙酶切，然后利用連接酶將基因克隆入基因載體pPIC3.5K-EGFP，構建融合基因表達載體pPIC3.5K-STK1-EGFP。

2.3 畢赤酵母GS115菌株電擊轉化感受態(tài)細胞的制備、轉化和篩選

畢赤酵母GS115菌株感受態(tài)細胞的制備、轉化和篩選參照高炳淼等方法[9]。

2.4 酵母轉化子的PCR鑒定

利用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母轉化子的基因組DNA，用和的特異引物進行PCR體系擴增：酵母DNA 40 ng，2.5 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，上下游引物 (10 μmoL/L) 各1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，r0.2 μL，補足ddH2O至20 μL。在PCR儀上94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s (m見表1)，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃保溫10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 試驗用引物及其用途

2.5和基因表達的RT-PCR檢測

參照Zuo等[10]的試驗對轉化子進行甲醇誘導表達。畢赤酵母菌總RNA的提取和第一條鏈的合成參照王梅娟等[8]的試驗方法進行，然后以獲得cDNA為模板進行EGFP和STK1序列的擴增檢測，體系如下：cDNA模板5 μL，10×緩沖液2 μL，dNTPs 1.5 μL，STK1 (或EGFP) 上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL，TMDNA聚合酶(5 U/μL) 0.15 μL，補ddH2O至20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。經(jīng)過電壓4 V/cm的瓊脂糖凝膠電泳20 min后，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2.6和基因表達的熒光檢測

用BMMY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母轉化子，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液 (Phosphate buffered saline，PBS) 懸浮菌體，激光共聚焦熒光顯微鏡 (Olympus FV1200) 觀察融合蛋白的熒光情況[11]并照相，利用ImageJ軟件對酵母細胞的熒光強度進行分析，每個實驗組選取100個酵母細胞[12]。

3 結果與分析

3.1和-融合基因載體的構建

通過提取玉米大斑病菌模式菌株01-23的總RNA反轉獲得的cDNA為模板，利用特異引物STK1-F1/STK1-R和STK1-F2/STK1-R進行PCR獲得大約1 071 bp的STK1-A和含有Kozak序列的STK1-B基因序列；以pEGFP-N1為模板，利用基因特異引物進行PCR獲得726 bp的綠色熒光蛋白的基因序列。首先將質粒pPIC3.5K和基因同時進行RⅠ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切、回收和連接最終獲得pPIC3.5K-EGFP質粒。再分別對STK1-A (或STK1-B) 基因和質粒pPIC3.5K-EGFP的RⅠ和Ⅰ酶切、回收和連接，獲得了pPIC3.5K- STK1-EGFP(A) (或pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)) 表達載體。經(jīng)過對pPIC3.5K-EGFP、pPIC3.5K- STK1-EGFP(A) 和pPIC3.5K- STK1-EGFP (B) 表達載體的酶切鑒定，3種表達載體結構正確 (圖1)，經(jīng)過生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，確定3種載體序列正確。

3.2 EGFP和STK1-EGFP酵母轉化子篩選和鑒定

通過電擊轉化，分別將pPIC3.5K-EGFP、pPIC3.5K-STK1-EGFP(A) 和pPIC3.5K-STK1- EGFP(B) 表達載體轉入畢赤酵母GS115中，通過在篩選培養(yǎng)基 (MD) 上的培養(yǎng)，獲得GS115-EGFP、GS115-STK1-EGFP(A) 和含有KozaK序列的GS115-STK1-EGFP(B) 3種轉化子。經(jīng)過在組氨酸缺失的MD培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉化子的生長速度顯著高于野生型，表明3種載體轉入了酵母基因組中，并得到了正常表達 (圖2A)。分別利用EGFP和STK1的引物對轉化子進行PCR鑒定，結果顯示GS115-EGFP轉化子中能夠獲得717 bp左右的特異片段；GS115-STK1- EGFP(A)、GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子也能夠擴增出1 071 bp左右的基因片段 (圖2B)。

圖1 質粒酶切鑒定

圖2 酵母轉化子的MD篩選(A) 和PCR (B)鑒定

3.3及-融合基因mRNA的檢測

試驗提取了酵母野生型GS115及其轉基因轉化子的總RNA，并通過Oligo(dT)18反轉錄成總cDNA。利用EGFP和STK1特異性引物分別對4種酵母總cDNA進行了檢測，在酵母野生型GS115和GS115-EGFP轉化子中沒有檢測到的mRNA，但是GS115-EGFP、GS115- STK1-EGFP(A) 和GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子中檢測到了721 bp的基因(圖3A)，而在酵母野生型GS115和GS115-EGFP(A) 轉化子中沒有檢測到基因的mRNA，但是GS115-STK1-EGFP (A) 轉化子和GS115-STK1- EGFP(B) 轉化子中檢測到了大約1 071 bp的基因(圖3B)。

3.4 STK1-EGFP融合蛋白在酵母中的熒光觀察

3.4.1 Kozak序列對STK1-EGFP融合蛋白表達載體的影響

在激光共聚焦顯微鏡下觀察GS115-STK1- EGFP(A) 和GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子發(fā)現(xiàn)，GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子的熒光強度顯著高于GS115-STK1-EGFP(A) 轉化子，利用Image J軟件分析發(fā)現(xiàn)GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子綠色熒光強度約為前者的4.8倍。表明在融合基因起始密碼子前加入Kozak序列(CCCACC) 顯著增強了融合蛋白表達的強度(圖4)。

3.4.2 STK1-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的熒光觀察

分別在明場和藍光激發(fā)的情況下觀察轉基因酵母的形態(tài)發(fā)現(xiàn)：GS115在激發(fā)條件下沒有發(fā)現(xiàn)熒光，而GS115-EGFP和GS115-STK1- EGFP(B) 轉化子的細胞中發(fā)現(xiàn)了清晰的綠色熒光，但是，與GS115-EGFP轉化子相比，GS115- STK1-EGFP(B) 轉化子的熒光在細胞內(nèi)局部區(qū)域呈現(xiàn)集聚態(tài) (圖5)。以上結果表明了EGFP蛋白和STK1-EGFP融合蛋白在酵母細胞中得到了正確表達，且STK1融合EGFP蛋白后并未影響EGFP的結構和功能；GS115-STK1-EGFP(B) 轉化子中熒光狀態(tài)顯著區(qū)別于GS115-EGFP轉化子，推測是由于STK1蛋白與酵母中Hog1信號蛋白具有結構和功能相似性[6,13]，STK1蛋白參與了Hog1信號蛋白的部分生理功能。

圖4 Kozak序列對STK1-EGFP融合蛋白在酵母中表達熒光強度的影響

圖5 不同轉化子在明場和藍光激發(fā)條件下的熒光結果

4 討論

大量研究表明，在動物、植物、真菌中MAPK級聯(lián)途徑是一條重要的細胞信號傳導途徑[14]，這些途徑調(diào)控著組織形態(tài)發(fā)生、細胞增殖和分化以及適應性免疫等一系列生理反應[15-17]。在植物與病原真菌互作的過程中，病原真菌的MAPK 級聯(lián)途徑參與調(diào)控其致病相關的過程，其中包括病菌分生孢子形成、附著胞發(fā)育及其侵入與定殖等[18-19]。

本試驗克隆了玉米大斑病菌基因，構建了基因和綠色熒光蛋白基因融合基因的表達載體pPIC3.5K-STK1-EGFP(A) 和含有Kozak序列的pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)，并經(jīng)過了酶切鑒定和測序分析，證明了表達載體序列準確。然后通過電擊轉化和營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基 (MD培養(yǎng)基) 初步篩選出了對應的酵母轉化子；利用對轉化子基因組DNA中基因和基因的PCR擴增及其mRNA的RT-PCR檢測，確定融合基因在插入了畢赤酵母基因組DNA中并能夠正常轉錄；最后，試驗利用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)融合基因表達蛋白在畢赤酵母細胞中發(fā)出綠色 熒光。

Kozak序列是提高基因表達的一個上游調(diào)控元件[20]，能夠調(diào)控起始翻譯過程，并且能決定翻譯效率[21]。本試驗通過構建pPIC3.5K-STK1- EGFP(A) 和含有Kozak序列的pPIC3.5K-STK1- EGFP(B)，并通過轉化畢赤酵母，獲得了相應的轉化子GS115-STK1-EGFP(A) 和GS115-STK1- EGFP(B)。熒光顯微鏡觀察顯示GS115-STK1- EGFP(B) 轉化子的熒光強度約是GS115-STK1- EGFP(A) 的4.8倍。表明構建融合基因表達載體pPIC3.5K-STK1-EGFP(B) 適用于畢赤酵母中誘導表達，且利于形成穩(wěn)定、高效表達融合蛋白的轉化子。

外源蛋白質在畢赤酵母中表達不僅可以用于蛋白功能的研究，而且在相關蛋白的晶體研究和抗體制備方面具有重要作用，例如張凱星等通過在酵母表達香蕉MaGBSSⅠ-3蛋白研究其生化特征[22]；Huo等在畢赤酵母GS115中表達源于維氏氣單胞菌幾丁質酶Chi92基因并研究其活性[23]；蔡立濤等[24]在畢赤酵母GS115中表達納豆激酶 (NK) 基因用于制備NK的抗體。雖然利用畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得外源重組蛋白技術已經(jīng)被廣泛應用[25]，但是研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母外源蛋白的產(chǎn)率較低[26-27]。Nocon等通過構建葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 () 和葡糖酸內(nèi)酯酶 () 過表達畢赤酵母轉化子可以使酵母中人血超氧岐化酶 (hSOD) 的產(chǎn)率提高3.8倍[28]。在本研究中僅利用構建的含有Kozak序列的表達載體轉化畢赤酵母，可以使GS115-STK1- EGFP(B) 轉化子STK1-EGFP融合蛋白產(chǎn)率提高4.8倍。本研究將為我們明確玉米大斑病菌STK1蛋白的細胞功能定位、STK1蛋白抗體制備奠定了基礎；為提高外源蛋白在畢赤酵母中產(chǎn)率的研究提供參考。

5 結論

本實驗構建了適于在畢赤酵母GS115中表達的載體pPIC3.5K-EGFP和pPIC3.5K-STK1- EGFP，建立了適宜本實驗要求的畢赤酵母轉化體系，篩選出了酵母轉化子；利用RT-PCR技術檢測了誘導酵母菌的和基因的mRNA情況；利用激光共聚焦熒光顯微鏡在轉基因酵母檢測到STK1-EGFP融合蛋白的熒光信號，證明了STK1蛋白在GS115中穩(wěn)定、高效表達。

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(本文責編 郝麗芳)

Construction offusion gene vector and its expression in

Yunfeng Zhang

Department of Life Sciences, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, Hebei, China

is one important MAPK gene regulating the conidial development, osmotic stress and pathogenicity of Setosphaeria turcica. At first, theGS115 expression vector pPIC3.5K-EGFP containing enhanced green fluorescent protein gene () was constructed, thengene was first amplified by PCR with the template of cDNA ofmodel isolate 01-23, and then cloned into the vector pPIC3.5K-EGFP with enhanced green fluorescent protein gene () to construct thefusion gene expression vector pPIC3.5K-STK1-EGFP. The vector was transformed into the susceptible cells ofGS115 by electric shock process, and the transformants were identified by MD medium screening and PCR determination. Thegene andgene could be expressed effectively and stably in the transformants as detected by RT-PCR and fluorescence observation. In addition, we also found that the Kozak sequence before the start codon ofgene could increase 4.8 folds expression level offusion gene. The above research results laid a good foundation for subcellular localization and antibody preparation of STK1 protein.

,fusion gene,, gene expression

10.13345/j.cjb.160406

October 28, 2016; Accepted:April 14, 2017

Yunfeng Zhang. Tel: +86-315-3863376; E-mail: zyfikx@126.com

Supported by: Science and Technology Research Project of Hebei Higher Education (No. QN2017415), Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2014105067), Hebei Overseas Students Science and Technology Activities Merit Aid Projects (No. C2015005009), Science Research Foundation of Tangshan Normal University (Nos. 2016C05, 2014E04).

河北省高等學?？茖W技術研究項目 (No. QN2017415)，河北省自然科學基金 (No. C2014105067)，河北省留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目(No. C2015005009)，唐山師范學院科學研究基金 (Nos. 2016C05, 2014E04) 資助。

網(wǎng)絡出版時間：2017-05-03

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