張衛(wèi)凱，胡志遠(yuǎn)，李智濤

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

基于柔性微電極芯片活體電穿孔提高PD-1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率

張衛(wèi)凱1，胡志遠(yuǎn)2，李智濤1

目的 開發(fā)一種柔性微電極芯片提高以PD-1質(zhì)粒為模版的DNA轉(zhuǎn)染效率。方法 運(yùn)用微機(jī)電系統(tǒng)加工柔性襯底的微電極芯片，在體外對HEK293細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒，驗(yàn)證柔性微電極芯片的可靠性。在活體動物進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染PD-1質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)，BALB/C小鼠共分3組，每組5只，分別給予0 V·cm-2, 100 V·cm-2, 200 V·cm-2不同電場強(qiáng)度進(jìn)行電穿孔，間接ELISA法檢測電轉(zhuǎn)后不同時(shí)間點(diǎn)的血清中抗PD-1抗體滴度。結(jié)果制備的柔性微電極芯片，能夠轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒到HEK293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白；在活體實(shí)驗(yàn)中，采用微電極芯片電穿孔免疫5次后2周，小鼠血清中PD-1抗體達(dá)到峰值。結(jié)論 基于柔性微電極芯片的活體電穿孔能夠有效提高DNA轉(zhuǎn)染效率，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

電穿孔；DNA轉(zhuǎn)染；PD-1

程序性死亡分子1 (programmed death-1,PD-1)又稱CD279，是一種表達(dá)于T細(xì)胞膜表面的負(fù)性免疫共刺激分子[1]。正常機(jī)體內(nèi)，組織細(xì)胞表面的PD-1配體(programmed death-ligand 1,PD-L1)與淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，抑制淋巴細(xì)胞活化，誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，從而在自身免疫耐受的形成以及防止自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá) PD-L1，抑制局部T淋巴細(xì)胞功能而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視[2-3]。通過對PD-1/PD-L1信號通路進(jìn)行阻斷，可有效提高T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果[4-5]。目前，在肺癌、淋巴瘤等疾病的臨床免疫治療中應(yīng)用PD-1單克隆抗體取得顯著的療效[6-9]。傳統(tǒng)方法采用原核細(xì)胞表達(dá)重組蛋白作為免疫原，由于缺乏糖基化修飾及正確的空間構(gòu)象，嚴(yán)重影響中和活性抗體的產(chǎn)生。DNA免疫將目的基因?qū)霗C(jī)體，表達(dá)天然蛋白，有利于產(chǎn)生特異性抗體[11]。但是傳統(tǒng)的基因槍轉(zhuǎn)染效率低，影響機(jī)體的免疫應(yīng)答效果。電穿孔技術(shù)是一種有效提高轉(zhuǎn)染效率的新技術(shù)[12-14]。本研究采用一種平行叉指電極的柔性聚對二甲苯芯片，提高DNA的轉(zhuǎn)染效率，增加目的蛋白表達(dá)，有效刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，透明質(zhì)酸酶(SIGMA公司)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)。硅片(天津西力卡公司)，PDMS(聚二甲基硅氧烷)(道康寧公司)，光刻膠(蘇州瑞紅電子化學(xué)品有限公司)，GFP質(zhì)粒(北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所趙德堯博士惠贈)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞系 雌性BALB/C小鼠，體質(zhì)量18～25 g，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司；HEK293 購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

1.1.3 主要儀器 電穿孔儀ECM 830(美國BTX公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司)。紫外光刻機(jī)(德國SUSS公司)，反應(yīng)等離子體刻蝕機(jī)RIE-200(德國SENTECH公司)，PDS2010聚對二甲苯涂層系統(tǒng)(美國NIST 公司)， Nanodrop 2000 (美國Thermo scientific 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柔性聚對二甲苯芯片的制備 采用微機(jī)電系統(tǒng)(micro-electro-mechanical system,MEMS)技術(shù)加工柔性聚對二甲苯芯片，基本操作過程如下：在直徑為13.3 cm圓形硅片上涂一層10 μm厚的聚對二甲苯薄膜作為基底，聚對二甲苯薄膜上濺射一層30 nm厚的金屬鉻作為聚對二甲苯薄膜和金之間的黏接層。金屬鉻上濺射0.1 μm的金作為種子層，種子層上涂一層15 μm厚的光刻膠作為掩膜層，光刻后在種子層上電鍍12 μm厚的金作為電極。為避免電鍍過程中光刻膠脫落，采用六甲基二硅氮烷 (hexamethyl-disilazane,HMDS)來增強(qiáng)光刻膠和種子層之間的黏結(jié)強(qiáng)度。電鍍結(jié)束依次用硝酸和氧等離子體去除光刻膠。分別用碘化鉀溶液和硝酸鈰銨溶液對整個(gè)貼片進(jìn)行處理，將多余的金/鉻種子層去除。在去離子水中將柔性聚對二甲苯襯底芯片從硅片上剝離。

1.2.2 PD-1 質(zhì)粒提取pCDNA3.1-PD-1-his 質(zhì)粒由北京科諾信誠生物有限公司提供。取2 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃加熱90 s, 冰中放置2 min。加入900 μL 液態(tài)LB培養(yǎng)基，200 r·min-1，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。涂于含有氨芐的固態(tài)LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，接種于5 mL含氨芐的液態(tài)LB 培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過度。接種到200 mL 液態(tài)LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h。收集菌液，室溫8000 r·min-1，離心2 min，徹底去除上清。按質(zhì)粒提取試劑盒操作說明書提取質(zhì)粒，Nanodrop 2000核酸定量儀檢測核酸濃度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 人腎上皮細(xì)胞系293(human embryonic kidney 293 cells，HEK293)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，含1%的雙抗(青霉素，鏈霉素)，10%的胎牛血清，細(xì)胞生長至對數(shù)期，收集細(xì)胞。細(xì)胞離心1000 r·min-1，5 min。用艾本德電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)·mL-1，然后加入GFP質(zhì)粒(2 g·L-1) 終濃度為20 mg·L-1，混合均勻。取20 μL 混合物滴加入柔性聚對二甲苯襯底芯片表面，并給予3個(gè)脈沖，電壓60 V，脈寬0.1 ms, 兩次脈沖間隔2 s。將電轉(zhuǎn)后的混合物轉(zhuǎn)入含有200 μL 培養(yǎng)基的微孔板中，放置37 ℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 動物活體電穿孔實(shí)驗(yàn) 取15只BALB/C小鼠，雌性，6～8周，隨機(jī)分為3組，每組5只。第一組，注射質(zhì)粒，不電轉(zhuǎn)；第二組：注射質(zhì)粒，低電壓100 V·cm-2電轉(zhuǎn)；第三組：注射質(zhì)粒，高電壓200 V·cm-2電轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)前1 d，采用商品化的脫毛膏，對小鼠脫毛預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在小鼠大腿上部肌肉注射透明質(zhì)酸酶，每只20 μL，作用20 min。取PD-1質(zhì)粒0.5 mL，注射至透明質(zhì)酸酶處理部位，10 min后進(jìn)行電穿孔。3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，每只30 μL。將柔性聚對二甲苯芯片，緊密貼合至小鼠后腿上部，芯片正負(fù)極連接至電穿孔儀ECM 830。調(diào)整電穿孔參數(shù)如下：0 V·cm-2, 100 V·cm-2和200 V·cm-2，分別進(jìn)行2次電轉(zhuǎn)，間隔1 min，每次5個(gè)脈沖，脈寬20 ms，脈沖間隔2 s。DNA免疫的周期：間隔7 d、7 d、10 d、10 d；從第4次免疫起，每次免疫后1周左右采血檢測。第75 d、78 d再次進(jìn)行電轉(zhuǎn)， 1周后采血檢測。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 取10 μg PD-1蛋白(1 g·L-1)，用0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.6稀釋至1 mg·L-1, 加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃孵育過夜；PBST 緩沖液洗1次，5%脫脂奶粉封閉，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后去除封閉液；小鼠血清均1∶1000稀釋，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL ，37 ℃孵育1h；同時(shí)加入陽性對照(PD-1蛋白免疫的小鼠血清)。PBST 緩沖液洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶5000), 每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗5次。最后每孔加入100 μL TMB試劑避光顯色10 min，每孔50 μL 2M H2SO4終止反應(yīng)。測定450 nm處吸光值。

2 結(jié)果

本研究的流程主要包括3個(gè)部分：①柔性聚對二甲苯襯底芯片的制備；②HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；③基于柔性芯片的活體電穿孔。

2.1 柔性聚對二甲苯襯底芯片的制備 用MEMS技術(shù)加工柔性微電極芯片，使用柔性較好的聚對二甲苯透明薄膜，同時(shí)可以作為金屬電極的絕緣層。由于金具有很好的導(dǎo)電性和生物兼容性，所以選擇金作為電極材料。作者設(shè)計(jì)的直角交叉式微電極，可以在微電極芯片形成均勻分布的電磁場。電極寬度和間隔分別為200 μm和500 μm。為了適應(yīng)實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤和肌肉組織的大小，電極芯片的有效區(qū)域設(shè)計(jì)為100 mm3。

2.2 PD-1質(zhì)粒提取 PD-1質(zhì)粒構(gòu)建譜圖如圖1所示。質(zhì)粒提取過程，按照試劑盒說明書進(jìn)行。Nanodrop 2000核酸定量儀檢測核酸濃度，用無菌水調(diào)整質(zhì)粒濃度為2 g·L-1。保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 PD-1質(zhì)粒圖譜 PD-1的C末端添加6×his標(biāo)簽

2.3 HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證柔性聚對二甲苯芯片的可靠性，用HEK293細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒后，接種于96孔板培養(yǎng)12 h，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況；如圖2所示：GFP有明顯表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率大約70%～80%左右。本實(shí)驗(yàn)說明，柔性聚對二甲苯芯片能夠有效地轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA至細(xì)胞內(nèi)，并表達(dá)蛋白。

A：表示明場；B：表示488 nm激發(fā)熒光；物鏡×10，標(biāo)尺50 μm。BF：Bright Field, GFP：Green Fluorescent Protein。圖2 HEK293細(xì)胞電轉(zhuǎn)染GFP

2.4 抗PD-1抗體滴度檢測 ELISA間接法檢測抗PD-1抗體的滴度，分別在第4次免疫后1周(31 d)采血檢測；第5次免疫后第1、2、3、4周(即41 d、48 d、56 d、63 d)采血檢測；第75 d、78 d免疫后1周(85 d)采血檢測。結(jié)果如圖3所示：A 組不電轉(zhuǎn)，檢測不到抗體滴度；B、C兩組施加電場,小鼠抗PD-1抗體滴度高于不施加電場的A組。高電場C組的抗體滴度高于低電場B組。本組實(shí)驗(yàn)說明，柔性聚對二甲苯襯底芯片能夠轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA至活體動物細(xì)胞，激發(fā)免疫應(yīng)答；通過增加的電場強(qiáng)度，可以提高轉(zhuǎn)染的效率，從而提升血清中抗PD-1抗體的滴度。第5次免疫后的2周，血清滴度達(dá)到峰值；第3、4周血清滴度持續(xù)降低。并于第75 d、78 d連續(xù)兩次加強(qiáng)免疫，1周后(85 d)采血檢測滴度仍持續(xù)下降。

A組：注射質(zhì)粒，不電轉(zhuǎn)；B組：注射質(zhì)粒，100 V·cm-2電壓；C組：注射質(zhì)粒，200 V·cm-2電壓；D組：陽性對照，PD-1蛋白免疫血清。圖3 小鼠免疫血清滴度

3 討論

電穿孔技術(shù)，通過瞬時(shí)電場使細(xì)胞膜形成微孔，使細(xì)胞胞外物質(zhì)在電場作用下，經(jīng)過電滲或離子電泳的作用，增加細(xì)胞攝取DNA，從而提高轉(zhuǎn)染效率[15]。目前，電穿孔技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，而且在臨床的基因治療方面，可以增強(qiáng)免疫效果，成為DNA免疫重點(diǎn)研究的方向[16-18]。

活體電穿孔技術(shù)在DNA轉(zhuǎn)染中，仍然有許多限制的條件，比如：免疫的周期、電穿孔脈沖參數(shù)、DNA體內(nèi)的降解等。在微電極芯片基底材料選擇上，本研究使用柔韌性較好的聚對二甲苯透明薄膜，讓芯片上的電極與具有不同表面輪廓的活體組織緊密接觸。同時(shí)，聚對二甲苯可以充當(dāng)金屬電極間的絕緣層。電極材料選擇上，本研究采用導(dǎo)電性和生物兼容性的金作為電極?；诖嗽O(shè)計(jì)的直角交叉式柔性微電極，在整個(gè)芯片電極區(qū)域形成均勻分布的電磁場。

HEK293細(xì)胞電轉(zhuǎn)染GFP 證明本方法能夠有效轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活體動物實(shí)驗(yàn)也表明本方法可以有效轉(zhuǎn)染PD-1質(zhì)粒并有效表達(dá)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。本研究中質(zhì)粒DNA免疫5次停止后，血清中抗PD-1抗體滴度持續(xù)下降，推測可能由于PD-1質(zhì)粒DNA在機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)蛋白，作為內(nèi)源性抗原，形成免疫耐受，也可能由于內(nèi)源性抗原誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答從而抑制了體液免疫應(yīng)答。

本研究成功研制的柔性聚對二甲苯微電極芯片，可以有效地提高DNA活體轉(zhuǎn)染效率，為基因免疫治療后續(xù)工作奠定良好的基礎(chǔ)。

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Improving Transfection Efficiency of PD-1 Plasmid DNA Based on Electroporation in Vivo of A Flexible Microelectrodes Chip

ZHANG Wei-kai1, HU Zhi-yuan2, LI Zhi-tao1

(Medical College,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China; National Center for Nanoscience, Beijing 100190, China)

ObjectiveTo develop a flexible microelectrodes chip improving transfection efficiency of PD-1 plasmid DNA.MethodsThe microelectrodes with a flexible substrate was fabricated based on micro-electro-mechanical system (MEMS). To verify the reliability of microelectrodes, GFP plasmid was employed to transfect HEK293 cells in vitro with electroporation. Then the electroporation experiments of PD-1 plasmid were performed with live animals in vivo. The BALB/C mice were divide into three groups (five mice per group) and exposed to different voltages, 0 V·cm-2, 100 V·cm-2, 200 V·cm-2respectively. The serum titers of PD-1 antibody were measured by indirect ELISA on different time points.ResultsBased on electroporation of flexible microelectrodes chip, GFP plasmid were efficiently delivered into HEK293 cell and express protein. PD-1 antibodies, which were derived from mice serum after 2 weeks of the fifth immunization, were reached to peak in vivo experiments.ConclusionThe electroporation based on flexible microelectrodes chip could improve the efficiency of DNA transfection and enhance the immune response in vivo.

electroporation; DNA transfection；programmed death-1

1672-688X(2017)02-0081-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.001

科技部863計(jì)劃(2015AA020408)

2017-05-02

1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003 2.國家納米科學(xué)中心，北京 100190

張衛(wèi)凱(1988—)，男，河南開封人，從事免疫學(xué)應(yīng)用研究。

李智濤，男，副教授，E-mail：lizhitao@haust.edu.cn

R392-33

A