劉 謙，劉麗麗，劉曉慧，張浛赫，王 宇，顏 紅，張漢民

(保定出入境檢驗檢疫局, 河北保定 071001)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測乳膠氣球中的亞硝胺及可亞硝化物

劉 謙，劉麗麗，劉曉慧，張浛赫，王 宇，顏 紅，張漢民

(保定出入境檢驗檢疫局, 河北保定 071001)

參照EN71：12—2013，對氣球中的13種揮發(fā)性亞硝胺及可亞硝化物進行了遷移提取、分離凈化，并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對其進行了定性和定量分析。氣球中的N-亞硝胺及前體物檢出限為0.05 mg/kg；回收率85.2%～113.6%，精密度3.23%～9.12%。運用該方法分析的氣球樣品中，N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二正丁基胺（NDBA）及其前體物檢出頻率最高，占N-亞硝胺總遷移量的比例最大；N-甲基-N-亞硝胺苯胺（NMPhA）、N-亞硝基-二乙醇胺（NDELA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基-雙-異丙基胺（NDiPA）、N-亞硝基二異丁胺（NDiBA）、N-亞硝基二異壬基胺（NDiNA）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亞硝基二芐胺（NDBZA）及其前體物均未檢出。該方法前處理過程簡單，靈敏度高，適用于批量樣品的快速分析。

N-亞硝胺；可亞硝化物；氣球；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

0 前 言

N-亞硝胺是一類有—N—N=O結(jié)構(gòu)的有機化合物，是目前已知最主要的強致癌物之一[1-8]。N-亞硝二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA） 屬于揮發(fā)性N-亞硝胺，具有一定的急性毒性、致癌性、致畸性和致突變性。亞硝胺廣泛存在于土壤、橡膠制品、皮革、化妝品、煙草及腌制食品中，可通過呼吸道、消化道等途徑進入人體[9-15]。食品、煙草、化妝品和橡膠制品等都可能存在N-亞硝胺的污染。橡膠制品中的N-亞硝胺主要來自以仲胺為基礎(chǔ)的硫化促進劑和硫磺給予體，這些物質(zhì)與空氣或配合劑中的氮氧化物反應(yīng)生成穩(wěn)定的N-亞硝胺。

氣球是一種常見的兒童橡膠玩具，在其加工過程中，硫化是最重要工藝之一，在高溫硫化、最終成型過程中會使用到硫化劑和硫化促進劑，為此氣球中檢出N-亞硝胺屢見不鮮。荷蘭學(xué)者分別于2002年7月和2004年7月對市場上氣球樣品中N-亞硝胺及其前體物的遷移量進行了普查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDMA、NDBA（N-亞硝基二正丁基胺）及其前體物在氣球樣品中被普遍檢出。為此，德國政府將氣球中N-亞硝胺及前體物的遷移限量設(shè)定為0.05 mg/kg和5 μg/dm2。2011年，幸苑娜等[4]用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對購自超市的氣球樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)NDMA、NDEA 及NDBA均有檢出。鑒于亞硝胺可對人體產(chǎn)生的毒害影響，歐盟指令EN 12868—1999明確規(guī)定在彈性體、橡膠奶嘴、安撫奶嘴中N-亞硝胺的遷移量不得超過10 μg/kg。2009年6月，歐盟新玩具指令2009/48/EC發(fā)布，歐盟統(tǒng)一禁用300多種亞硝胺類化合物，并于2013年6月首次發(fā)布了EN 71：12—2013《玩具安全-第12部分：N-亞硝胺和N-亞硝基化合物》標(biāo)準(zhǔn)，限定了供3歲以下兒童使用的彈性體材料制造的玩具（含氣球）限量為0.05 mg/kg。我國對橡膠、彈性體材料中的N-亞硝胺也加以限制，規(guī)定其含量不得超過500 μg/ kg[16-20]。

面對美國和歐盟越來越嚴(yán)格的氣球中亞硝胺的限量要求，建立合理、快速、準(zhǔn)確的氣球中N-亞硝胺及可亞硝化物含量的測定方法尤為重要。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對氣球中13種亞硝胺及可亞硝化物進行了檢測，并對檢出情況進行深入分析。結(jié)果表明，該方法選擇性強，靈敏度高，操作簡便。

2 試 驗

2.1 儀器和設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ESI源），美國Waters公司；梅特勒天平，瑞士梅特勤公司；PНS-3C精密рН計（上海雷磁公司）；SНA-B恒溫水浴振蕩器，常州國華電器公司。

2.2 試劑與材料

N-甲基-N-亞硝胺苯胺（NMPhA，純度＞99.5%）、N-亞硝基-乙二醇胺（NDELA，97.7%）、N-亞硝基嗎啉（NMOR，99.0%）、N-亞硝基二丙胺（NDPA，98.8%）、N-亞硝基-正二丁胺（NDBA，99.1%）、N-亞硝基哌啶（NPIP，99.2%）、N-亞硝基二乙胺（NDEA，99.5%）、N-亞硝基-雙-異丙基胺（NDiPA，99.0%）、N-亞硝基二異丁胺（NDiBA，97.0%）、N-亞硝基二異壬基胺（NDiNA，96.0%）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA，97.0%）、N-亞硝基二芐胺（NDBZA，96.0%）、N-亞硝基二甲基胺（NDMA，99.5%），均購自德國Dr.公司；碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鉀、亞硝酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2.3 樣品前處理

2.3.1 模擬唾液

參考EN 71：12—2013標(biāo)準(zhǔn)，將碳酸氫鈉4.2 g、氯化鈉0.5 g、碳酸鉀0.2 g和亞硝胺30.0 mg溶于蒸餾水中，用蒸餾水稀釋至900 mL,用0.1 mоl(xiāng)/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)рН至9.0，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度線。

2.3.2 N-亞硝胺處理過程

把氣球縱向切成兩半，獲得近對稱塊；根據(jù)樣品質(zhì)量再縱向剪成兩半，再次得到兩個近對稱塊。稱取3.5～4.5 g樣品，于50 mL錐形瓶中加入10倍樣品量的、預(yù)熱至（40+2）℃的模擬唾液，確保樣品完全浸入[必要時加入已預(yù)熱至（40+2）℃的玻璃珠]，該浸泡液于（40+2）℃的水浴中浸泡（60+3）min。將測試液轉(zhuǎn)移至50 mL具塞量筒中，該測試液用于N-亞硝胺的測試。

2.3.3 亞硝化處理過程

取2.3.1的測試液5 mL，于離心管中加入0.5 mL的1 mоl(xiāng)/L 鹽酸溶液，蓋緊混勻，于（40+2）℃水浴中保持（30+1）min；加入1.0 mL 的 1 mоl(xiāng)/L氫氧化鈉溶液，混合均勻。該測試液即為可亞硝化的N-亞硝胺的測試液。

2.4 儀器分析

2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：CNW C18，100 A，5 μm，長150 mm，內(nèi)徑2.1 mm；流動相：洗脫程序詳見表1；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣：50 L/h；霧化氣：800 L/h；離子源溫度：120 ℃。定性離子對、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量詳見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理條件

本方法選擇了EN 71：12—2013的前處理條件，這主要是因為該方法流程簡單，節(jié)約時間和人力，可以同時檢測大量樣品，有機試劑的使用量小，減輕了對人體和環(huán)境的污染。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 流動相的選擇

在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析中，流動相的組成既影響目標(biāo)化合物的色譜峰形和分離效果，又影響其離子化效率和質(zhì)譜檢測靈敏度。本方法比較了甲醇-水。乙腈-水對化合物在C18色譜柱上分離的效果。結(jié)果表明，在甲醇-水、乙腈-水體系中，13種化合物均能得到對稱的峰形，考慮到在甲醇水體系中更容易形成[M+Н]+,本文選用甲醇-水作為流動相。為了進一步提高化合物的離子化效率，在純水體系里分別添加了0.05%、0.1%、0.2%三個濃度的甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸濃度不同對出峰的對稱性和靈敏度都有影響。當(dāng)流動相添加0.1%的甲酸時，峰形對稱、信噪比高、靈敏度好，因此本方法最終選擇甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作流動相。

3.2.2 質(zhì)譜條件的選擇

13種N-亞硝胺類化合物均含有—N—N=O結(jié)構(gòu)，在ESI+模式下均能夠通過加合Н離子得到準(zhǔn)分子離子峰。在確定待測化合物監(jiān)測的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對離子源溫度、霧化氣流量及溫度、碰撞電壓等條件進行優(yōu)化。分別將13種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品用初始流動相稀釋成1 μg/mL的工作液，在ESI+的模式下對各分析物進行質(zhì)譜優(yōu)化，通過選擇離子監(jiān)測優(yōu)化去簇電壓，再通過優(yōu)化碰撞能量對子離子進行全掃描，最終選擇響應(yīng)值最大、豐度最強、干擾最小的為子離子（表2）。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，13種N-亞硝胺類化合物分別被配置成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，以信噪比S/N=3 計算儀器檢出限，其線性方程和相關(guān)系數(shù)詳見表3。13種亞硝胺在線性范圍為10～200 ng/mL之間線性關(guān)系良好，線性方程相關(guān)系數(shù)r2均大于等于0.990。檢出限為0.05 mg/kg。

表3 13種亞硝胺的曲線線性方程及線性范圍

3.4 回收率及精密度

按照2.3方法對未檢出亞胺類物質(zhì)的空白氣球樣品做13種亞硝胺的加標(biāo)回收實驗，添加水平分別為50、100、500 ng/mL，每組有6個平行樣品，上機測試N-亞硝胺物質(zhì)及其前體物的含量。通過計算得到目標(biāo)物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果詳見表4。13種亞硝胺的回收率為85%～113%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.23%～9.12%。

表4 13種亞硝胺的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)

3.5 樣品結(jié)果分析

3.5.1 氣球中13種N-亞硝胺的平衡遷移量

根據(jù)文獻[4,8]介紹，兒童接觸氣球的時間遠遠低于接觸奶嘴的時間，EN 71：12—2013將模擬遷移時間由24 h改為1 h。為了確定氣球制備時的溫度和時間對氣球中亞硝胺及可亞硝化物含量的影響，按表5的條件制作了照EN 71：12—2013的實驗方法對氣球做了模擬遷移實驗，實驗結(jié)果見表6。

表5 乳膠氣球制備條件

從表6可以看出，所分析的16個樣品中，NDMA的檢出率最高，在12個樣品中有檢出，檢出含量0.041 2～1.980 0 mg/kg；其次是NDEA，有10個樣品檢出，平衡遷移量0.025 4～1.590 0 mg/kg。NDBA的前體物檢出也較多；在NDEA和NDMA的前體物同樣有檢出，且前體物遷移量高于NDEA和NDMA的遷移量，平衡遷移量分別為0.125～1.590 mg/kg和0.325～1.770 mg/kg；而NDBA在A5樣品中有檢出，但是其前體物未檢出，在A7、A8、B7、B6、B8前體物有檢出，但是亞胺類物質(zhì)卻未檢出。其他10種亞胺類物質(zhì)及前體物均未檢出。這一現(xiàn)象在荷蘭RIVM實驗室的測試結(jié)果中也有體現(xiàn)。在本研究中，NDBA及前體物在樣品中的檢出頻率不一致，如A5-1檢出但A5-2未檢出，造成這種現(xiàn)象的原因有待于進一步研究。

表6 氣球中N-亞硝胺遷移量

（續(xù)前表）

3.5.2 溫度和反應(yīng)時間對亞胺類物質(zhì)的影響

從表5和6的結(jié)果可以得出隨著溫度的升高，亞硝胺及可亞硝化物的含量會隨之增加的結(jié)論。當(dāng)溫度低于40 ℃時，亞硝胺及可亞硝化物均沒有檢出；當(dāng)溫度高于40 ℃，NDMA、NAEA開始檢出并隨著溫度的增高含量逐漸增加。

本文分別實驗了制備時間為3.0和3.5 h對氣球中N-亞硝胺和可亞硝化物含量的影響，結(jié)果表明，在相同溫度下制備時間為3.5h的比3 h的氣球中N-亞硝胺的含量及可亞硝化物的含量高。

4 結(jié) 論

采用EN 71：12—2013 對氣球中亞硝胺及可亞硝化物進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其前處理過程簡便，檢測靈敏度高。另外，氣球生產(chǎn)過程中的反應(yīng)時間和溫度都對氣球中的亞硝胺及可亞硝化物含量有一定影響：隨著反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的增加，氣球中可亞硝化物和亞硝胺的含量都會增加。氣球企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)該適當(dāng)控制反應(yīng)溫度和時間，以減少亞硝胺的生成。

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[責(zé)任編輯：朱 胤]

TQ330.7+2

B

1671-8232(2017)05-0030-06

2016-04-25

劉謙（1980— ），女，碩士，工程師，主要從事食品中藥物殘留、各類添加劑、輕紡制品有毒有害物質(zhì)檢測工作。