高建德，朱曉玉，劉雄，陳暉，宋開蓉，師婷婷

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響應面法優(yōu)化復合酶提取枸杞子總黃酮的工藝研究

高建德，朱曉玉，劉雄，陳暉，宋開蓉，師婷婷

甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅蘭州 730000

目的 采用響應面法優(yōu)化復合酶提取枸杞子總黃酮的工藝條件。方法 在單因素試驗基礎上，選擇酶用量、酶解時間、酶解溫度為因素，進行3因素3水平的中心組合設計，采用響應面法分析3個因素對枸杞子總黃酮得率的影響。結(jié)果 復合酶輔助提取枸杞子總黃酮的工藝路線為：復合酶用量0.30%，酶解時間1.0 h，酶解溫度60 ℃?？傸S酮得率預測值為0.949 2%。結(jié)論 響應面法優(yōu)化復合酶輔助提取枸杞子總黃酮的方法穩(wěn)定可行，操作簡單，可為深入研究及應用提供依據(jù)。

響應面法；工藝優(yōu)化；復合酶提??；枸杞子總黃酮

枸杞子是茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實[1]，性平，味甘、微苦，無毒，具有滋養(yǎng)肝腎、潤肺益氣、生精助陽、明目等功效。黃酮類化合物是枸杞子的有效組分之一，具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、清除自由基[5]、抗炎[6]等作用。目前，黃酮類化合物的提取方法主要有回流提取法[7-8]、超聲提取法[9-10]、微波輔助提取法[11]及CO2超臨界流體萃取法[12]。生物酶技術(shù)具有提取效率高、提取時間短、綠色環(huán)保及提取條件溫和等優(yōu)勢[13]，近年來在中藥黃酮類、多糖類、生物堿類等有效組分提取中均有廣泛應用。生物酶輔助提取枸杞子的有效組分雖有報道，但以研究提取枸杞子多糖[14-15]為主，而在提取枸杞子黃酮類成分方面報道甚少。本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化復合酶提取枸杞子總黃酮的工藝，為枸杞子的綜合利用及提高黃酮類化合物的提取率提供一定的試驗基礎。

1 儀器與試藥

UV Blue Star B型紫外-可見分光光度計（北京萊佰泰科技有限公司），DD-5M離心機（湘儀離心機儀器有限公司），AL104型電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），HH-4電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），AKRYUP-1816超純水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司），PHS-3E pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

枸杞子（批號20150923），購于蘭州黃河藥市，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實；蘆丁對照品（批號10080-200707），中國食品藥品檢定研究院；果膠酶（批號CNC1048446715）、纖維素酶（批號CNC1048447624），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

稱取枸杞子10.0 g，粉碎，過1號篩，加8倍量石油醚脫脂（2次，1.5 h/次），藥渣風干。風干后的藥渣裝入燒杯，按照不同的酶用量、酶解溫度、酶解時間，加入一定量磷酸緩沖液（pH＝4.2）進行酶解提取，過濾，酶解提取后的藥渣加10倍量水提取2次，1 h/次，提取液濃縮至浸膏（每1 mL濃縮液相當于0.5 g原藥材），冷卻，加無水乙醇至含醇量達65%，靜置過夜，3500 r/min離心10 min，移取上清液5 mL置于50 mL容量瓶中，65%乙醇定容，作為待測溶液。

2.2 標準曲線制作與總黃酮得率計算

準確稱取經(jīng)干燥至恒重的蘆丁對照品0.010 g，置于50 mL容量瓶中，加入65%乙醇溶液定容，即得蘆丁對照品溶液。分別精確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶中，各加入65%乙醇2.0 mL，再各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，分別加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，最后用65%乙醇定容，搖勻，室溫放置15 min，以加入純水、其他試劑相同的溶液為參比液，在波長510 nm處測其吸光度。以蘆丁對照品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，得回歸方程＝0.523－0.010 9（2＝0.999 4）。根據(jù)回歸方程計算總黃酮濃度，求得總黃酮得率（浸出總黃酮質(zhì)量÷枸杞子質(zhì)量×100%）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 液料比對提取效果的影響 以總黃酮得率為指標，脫脂后的藥渣，復合酶（果膠酶∶纖維素酶＝1∶1，pH＝5.31）用量0.20%，加入pH 4.2磷酸緩沖液，50 ℃酶解1.5 h，酶解后的藥渣加10倍量水回流提取2次，每次1 h，考察不同液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1）對枸杞子總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1?？梢?，液料比在6∶1～10∶1范圍內(nèi)時，枸杞子總黃酮得率隨著液料比的增加而提高，呈上升趨勢；液料比大于10∶1時，枸杞子總黃酮得率雖有所下降，但下降趨勢不明顯，基本趨于平行。故選用10∶1作為最佳液料比。

圖1 液料比對枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.2 酶用量對提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標，50 ℃酶解1.5 h，加入pH 4.2緩沖液，考察復合酶用量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對提取效果的影響，酶解后的藥渣按液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。結(jié)果見圖2?？梢?，復合酶用量在0.10%～0.25%時，隨著酶濃度的增加，枸杞子黃酮得率亦增大，呈上升趨勢；酶用量在0.25%～0.30%時，枸杞子黃酮得率呈下降趨勢，但下降幅度不大。因此，在響應面試驗中選取0.15%～0.25%范圍進行優(yōu)化。

圖2 酶用量對枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.3 酶解溫度對提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標，復合酶用量為0.20%，酶解時間為1.5 h，加入pH 4.2緩沖液，考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對提取效果的影響，酶解后的藥渣，按照液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。結(jié)果見圖3?？梢?，在溫度40～50 ℃時，枸杞子黃酮得率隨酶解溫度的升高而呈上升趨勢；在溫度55 ℃時，枸杞子總黃酮得率略有下降，可能是誤差所致。因此，在響應面試驗中，選取40、50、60 ℃作為酶解溫度的3個水平。

2.3.4 酶解時間對提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標，復合酶用量為0.20%，酶解溫度50 ℃，加入pH 4.2緩沖液，考察酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對提取效果的影響，酶解后的藥渣，按照液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，結(jié)果見圖4?？梢?，酶解時間為0.5～1.5 h時，枸杞子總黃酮得率隨時間延長呈上升趨勢；酶解時間為1.5～2.5 h，枸杞子總黃酮得率雖有小幅增長，但增幅并不明顯。故在響應面試驗中選取1、1.5、2 h作為酶解時間的3個水平。

圖3 酶解溫度對枸杞子總黃酮得率的影響

圖4 酶解時間對枸杞子總黃酮得率的影響

2.3.5 pH值對提取效果的影響 以枸杞子總黃酮得率為指標，復合酶用量為0.20%，在50 ℃酶解1.5 h，考察pH值（4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）對提取效果的影響，酶解后的藥渣，按液料比為10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，結(jié)果見圖5?？梢?，pH值4.0～4.2時，總黃酮得率隨著pH值增大而呈上升趨勢；pH值4.4～5.2時，枸杞子總黃酮得率不再上升，反而呈下降趨勢。故選用pH值4.2為宜。

圖5 pH值對枸杞子總黃酮得率的影響

2.4 響應面試驗設計及結(jié)果

在單因素試驗的基礎上，選取3因素3水平的響應面分析試驗（見表1），根據(jù)中心組合設計原理，以復合酶用量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）為自變量，枸杞子總黃酮得率為響應值進行試驗分析，結(jié)果見表2。所得數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件得到回歸方程：＝0.74＋0.038＋0.051＋0.072－0.016－3.025×10-3－0.064＋0.0592＋0.0652－0.0532。采用SAS RSREG回歸分析對方程和方程的各個因子進行分析，結(jié)果見表3。

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性用檢驗來判定，值越小，則相應變量的顯著程度越高，＜0.01時影響為極顯著，＜0.05時影響為顯著。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷各因素對枸杞子總黃酮得率影響的主次順序為C（酶解溫度）＞B（酶解時間）＞A（酶用量）。

表1 響應面法設計因素水平表

表2 星點設計方案及試驗結(jié)果

表3 響應面法統(tǒng)計分析結(jié)果

由表3可知，此模型＜0.000 1，表明響應面回歸達到極顯著水平，說明模型回歸顯著可靠，A（酶用量）、B（酶解時間）和C（酶解溫度）對枸杞子總黃酮得率的影響極顯著（＜0.01），同時，B（酶解時間）和C（酶解溫度）的交互作用對枸杞子總黃酮得率影響極顯著，A（酶用量）、B（酶解時間）和C（酶解溫度）的平方項對枸杞子總黃酮得率的影響極顯著，說明A（酶用量）、B（酶解時間）和C（酶解溫度）對枸杞子總黃酮得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，平方項和交互項也具有很重要的作用，這與模型分析的結(jié)果相同。此響應面模型2為95.93%，說明模型響應值（總黃酮得率）的變化95.93%來自所選的因變量?；貧w方程可以較好地描述與響應值之間的真實關(guān)系，利用此回歸方程對試驗結(jié)果進行計算是合理可靠的。

2.5 響應面圖分析結(jié)果

通過多元回歸方程所作的響應面及等高線圖見圖6～圖8，所擬合的響應曲面和等高線圖能比較直觀地反映各因素間的交互作用。

由圖6可知，當酶用量較低時，隨酶解時間的增加，枸杞子總黃酮得率增長較快，當酶用量增大時，酶解時間越長，枸杞子黃酮得率反而會有所下降。枸杞子總黃酮得率極大值在酶用量0.15%～0.25%、酶解時間1～1.6 h。

由圖7可知，酶用量不變，隨著酶解溫度升高，枸杞子總黃酮得率呈上升趨勢，當酶解溫度在40～45 ℃范圍時，枸杞子總黃酮得率較高。當酶解溫度恒定時，酶用量在0.15%～0.25%范圍內(nèi)，枸杞子總黃酮得率隨著酶濃度增大而上升。

由圖8可知，酶解時間不變，酶解溫度對枸杞子總黃酮得率的影響呈先增后減的趨勢。酶解溫度恒定時，酶解時間對枸杞子總黃酮得率的影響呈現(xiàn)上升的趨勢。枸杞子總黃酮得率的極大值在酶解時間1.0～2.0 h、酶解溫度45～60 ℃。

通過以上響應面圖可以直觀分析各因素之間的交互作用對效應值枸杞子總黃酮得率的影響，并根據(jù)回歸方程優(yōu)選出枸杞子總黃酮酶解提取的最佳工藝條件為：酶用量0.30%，酶解時間1.0 h，酶解溫度60 ℃。枸杞子總黃酮得率預測值為0.949 2%。

2.6 驗證試驗

精密稱取枸杞子10.0 g，共5組，粉碎，按優(yōu)化的工藝條件提取枸杞子總黃酮，測得總黃酮得率平均值為0.930 3%，RSD＝0.94%。

2.7 酶解提取與傳統(tǒng)水提法比較

分別稱取枸杞子10.0 g，共6份。3份按最優(yōu)的工藝條件提取枸杞子總黃酮；另外3份不加酶，以相同溫度浸泡相同時間，加10倍量水，回流提取2次，1 h/次，比較2種方法的枸杞子總黃酮得率。結(jié)果見表4。可見，酶解提取法所得枸杞子總黃酮得率明顯高于傳統(tǒng)水提法，說明生物酶在60 ℃溫度下仍然可以破壞枸杞子藥材結(jié)構(gòu)，使其總黃酮得到更有效的釋放。酶解提取枸杞子總黃酮方法操作簡單，工藝穩(wěn)定、可行。

表4 酶解提取與傳統(tǒng)水提法枸杞子總黃酮得率比較（%）

3 討論

響應面法是近年來國內(nèi)外常用的試驗設計方法，相對于正交設計、均勻設計等試驗設計方法，響應面法可以精確地找到最佳點，靈敏地考察各因素的交互作用，適用于中藥材提取工藝的優(yōu)選[16-17]。回歸分析結(jié)果表明，酶用量、酶解時間和酶解溫度對枸杞子總黃酮得率具有顯著影響；提取過程中，酶解時間和酶解溫度的交互作用對枸杞子總黃酮得率的影響極顯著，表明這3個因素對枸杞子總黃酮得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此，在響應面優(yōu)化試驗時，酶解溫度選擇40、50、60 ℃這3個水平，考慮溫度跨度大，運用響應面法可更好地選擇枸杞子總黃酮酶解的最佳溫度。

本試驗優(yōu)化所得的酶解溫度為60 ℃，廠家提供纖維素酶的使用溫度為30～60 ℃，果膠酶在60 ℃時可縮短澄清果汁的時間，說明這2種酶在60 ℃時仍具有活性。魏金瑩[18]采用纖維素酶提取貝母中的貝母堿，其最優(yōu)提取條件為酶解溫度60 ℃、酶解時間為3.5 h，說明纖維素酶在60 ℃條件下活性可達2 h以上。

枸杞子總黃酮得率響應方程的回歸分析和驗證試驗表明，此方法合理可行。復合酶提取枸杞子總黃酮的最佳條件為：酶用量0.30%，酶解時間1.0 h，酶解溫度60 ℃。枸杞子總黃酮得率的預測值為0.949 2%，驗證值為0.930 3%，與預測值的相對誤差為0.018 9%。

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Optimization of Compound Enzyme Extraction Technology of Total Flavonoids from Lycii Fructus by Response Surface Method

GAO Jian-de, ZHU Xiao-yu, LIU Xiong, CHEN Hui, SONG Kai-rong, SHI Ting-ting

Objective To optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus by response surface methodology (RSM). Methods On the basis of single-factor tests, enzyme concentration, enzymolysis time, and enzyme solution temperature were selected as influencing factors during extraction to conduct three-factor three-level center combination design. The effects of three factors on the yield of total flavonoids from Lycii Fructus were analyzed by RSM. Results The optimum conditions for extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus were enzyme concentration 0.30%, enzymolysis time 1.0 h, enzyme solution temperature 60 ℃. The predicted extraction yield of total flavonoids was 0.949 2%. Conclusion Using RSM to optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus is stable, feasible, and simple, which can provide references for further study and application.

response surface method; technology optimization; compound enzyme extraction; total flavonoids from Lycii Fructus

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.016

R284.2

A

1005-5304(2017)07-0066-06

甘肅省科技攻關(guān)項目（GYC13-05）；甘肅省高等學?？茖W研究項目（2015B-073）

劉雄，E-mail：lx@gszy.edu.cn

（2016-08-31）

（2016-09-27；編輯：陳靜）