陳志春，王英豪，張理平，蘭明金

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祛斑中藥組方干預(yù)黑素合成的主效應(yīng)中藥剖析

陳志春1，王英豪2，張理平2，蘭明金2

1.福州屏山制藥廠，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122

目的 解析祛斑中藥組方干預(yù)黑素合成的主效應(yīng)中藥。方法 采用3×2析因設(shè)計(jì)，以山楂、當(dāng)歸、山萸肉為考察因素，各設(shè)2水平，分別測(cè)定酪氨酸酶活性抑制率、多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量、多巴自動(dòng)氧化抑制率，并運(yùn)用SPSS16.0軟件輔助解析祛斑組方對(duì)干預(yù)黑素合成不同途徑的主效應(yīng)中藥。結(jié)果 組方中山萸肉對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（＜0.05），山萸肉、當(dāng)歸對(duì)多巴色素自動(dòng)氧化生成的黑素量具有極顯著抑制作用（＜0.01），山萸肉、當(dāng)歸對(duì)多巴自動(dòng)氧化具有顯著抑制作用（＜0.05），山萸肉在組方中貢獻(xiàn)最大。結(jié)論 山萸肉為組方中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量、多巴自動(dòng)氧化的主效應(yīng)中藥。

析因設(shè)計(jì)；酪氨酸酶；黑色素；祛斑中藥復(fù)方；效應(yīng)中藥

1 儀器與試藥

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司），電子分析天平（FA20004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司），數(shù)顯水浴鍋（HH.S，上海錦屏儀表有限公司），離心機(jī)（Anke TDL80-2B，廠家上海安亭科學(xué)儀器廠），微量移液器（PIPETTOR，WKY型，100～500 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）。

山楂（批號(hào)20140505）、當(dāng)歸（批號(hào)20141118）、山萸肉（批號(hào)20141023）購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車蘇容副教授鑒定，分別為薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實(shí)、傘形科植物當(dāng)歸（Oliv.）Diels的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。酪氨酸酶（SIGMA，CAS9002-10-2，EC232-653-4，USA，MSDS）；左旋多巴（-Dopa，西安潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司，批號(hào)060108）；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考前期研究結(jié)果[1-4]，本試驗(yàn)選用3×2析因設(shè)計(jì)表，以山楂、當(dāng)歸、山萸肉為考察因素，每個(gè)因素設(shè)2個(gè)水平，進(jìn)行組方設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），得到析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案（見(jiàn)表2），其中1行為1種組方，按表中各行數(shù)值取相應(yīng)藥味混合即得，共8組。

表1 析因設(shè)計(jì)因素水平表（g）

表2 析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案

2.2 組方制備

將組方（山楂、當(dāng)歸、山萸肉等）飲片分別粉碎成粗粉（40目），分別稱取適量粉末于具塞三角瓶中，加入適量乙醇，混勻，浸泡0.5 h，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）1 h，提取2次，分別過(guò)濾，減壓回收乙醇，制得濃度為250 g/L的藥液，備用。

1.2 峨眉武術(shù)的歷史演進(jìn)挖掘 峨眉武術(shù)作為中國(guó)民族傳統(tǒng)武術(shù)流派重要的一支，自其發(fā)展之初，便依托以中國(guó)著名的峨眉山為根基傳播峨眉武術(shù)文化。《峨眉拳譜》一書中曾記載描述“一樹(shù)五花，五花八葉扶，皎皎峨眉月，光輝滿江湖?！盵4]其中一樹(shù)泛指峨眉武術(shù)，五花指巴蜀的5個(gè)地理區(qū)域，即四川省青城山的青城派，金堂云頂山的鐵佛派，四川青牛山的青牛派，四川涪陵點(diǎn)易派以及榮昌、隆昌兩地的黃林派；而八葉則指當(dāng)今四川武術(shù)中普遍認(rèn)同的僧門、岳門、趙門、杜門、洪門、化門、字門、會(huì)門8個(gè)著名門派。八葉與《峨嵋拳普》中記載的基本一致，泛指當(dāng)今巴蜀流傳的趙門、僧門、岳門、杜門四大家以及洪門、化門、字門、會(huì)門四小家。

2.3 酪氨酸酶活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[6]方法，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性，反應(yīng)混合物與體積見(jiàn)表3，計(jì)算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶抑制率（%）＝[（A475a－A475b）－（A475c－A475d）]/（A475a－A475b）×100%。式中，a為未加中藥的加酶混合液，b為未加中藥和酶的混合液，c為加中藥和酶的混合液，d為加中藥而未加酶的混合液。

表3 反應(yīng)混合物與體積（mL）

2.4 多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量測(cè)定

將酪氨酸酶試液（135 U/mL）0.5 mL在25 ℃溫育10 min，加入多巴溶液（0.03%）0.5 mL，一起溫育5 min，然后分別加入PBS溶解的受試物0.5 mL（500、200、50 μg/mL）并溫育60 min，加入1 mol/L鹽酸2 mL終止反應(yīng)，將該混合物于3000 r/min離心15 min，沉淀物分別用6 mol/L鹽酸1 mL洗1次、雙蒸水洗2次，然后用1 mol/L NaOH溶液2 mL充分溶解離心團(tuán)塊，用分光光度計(jì)在400 nm處測(cè)定吸光度（OD值）。以黑素量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝5.1＋0.47（＝0.999 9）。結(jié)果表明黑素量在0～160 μg/mL范圍內(nèi)OD值與黑素量呈良好的線性關(guān)系。通過(guò)黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組方黑素生成量。

2.5 多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)測(cè)定

將3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS稀釋過(guò)的受試物（50、10、2 mg/mL）混合，在空氣中（25 ℃）暴露4 d，然后用分光光度計(jì)在475 nm處測(cè)定OD值，以PBS代替受試物作為空白對(duì)照，計(jì)算各組方對(duì)多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)的抑制作用。

2.6 解析組方中主效應(yīng)中藥

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，指標(biāo)測(cè)定結(jié)果以±表示，析因分析采用檢驗(yàn)，＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別解析祛斑中藥中抑制酪氨酸酶活性、多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量、抗多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)的主效應(yīng)、交互效應(yīng)、單獨(dú)效應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1 各組方對(duì)黑素合成的影響

各組方干預(yù)黑素合成各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率析因分析

各組方酪氨酸酶活性抑制率析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應(yīng)中2條直線均相互平行，說(shuō)明因素間不存在交互作用，即組方對(duì)酪氨酸酶的抑制不存在交互效應(yīng)，故只需考慮各因素的主效應(yīng)作用。由檢驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表5）可知，C＞B＞A，其中C因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），B、C因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）?？梢?jiàn)，C因素（山萸肉）的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于A因素（山楂）、B因素（當(dāng)歸），處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，尤以山萸肉水平2對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用，是復(fù)方中酪氨酸酶活性抑制的主效應(yīng)中藥。

表4 各組方干預(yù)黑素合成結(jié)果

表5 酪氨酸酶抑制率析因方差分析表

3.3 多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素含量析因分析

多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素含量析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應(yīng)中2條直線均相互平行，說(shuō)明因素間不存在交互作用，即組方抑制多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量不存在交互效應(yīng)，故只需考慮各因素的主效應(yīng)作用。由檢驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表6）可知，B＞C＞A，其中B、C因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），A因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。B因素（當(dāng)歸）、C因素（山萸肉）的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于A因素（山楂），處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，其中當(dāng)歸水平1、山萸肉水平2對(duì)多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量的抑制明顯，是復(fù)方中抑制多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量的主效應(yīng)中藥。

表6 多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素量析因方差分析表

3.4 抗多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)析因分析

多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)抑制試驗(yàn)析因分析結(jié)果顯示，A、B、C因素兩兩交互效應(yīng)中AC因素、BC因素2條直線相互不平行，說(shuō)明兩因素可能存在交互作用，即組方對(duì)多巴自動(dòng)氧化的抑制存在交互效應(yīng)，故需考慮交互作用。由檢驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表7）可知，B＞C＞A×C＞A＞B×C，其中B、C因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），A、A×C、B×C因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）?？梢?jiàn)，C因素與A、B因素存在交互作用，但無(wú)顯著影響，故主要分析主效應(yīng)中藥。C因素（山萸肉）、B因素（當(dāng)歸）的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于A因素（山楂），處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，尤以當(dāng)歸水平2、山萸肉水平1對(duì)多巴自動(dòng)氧化具有顯著抑制作用，是復(fù)方中抗多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)的主效應(yīng)中藥。

表7 抗多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)析因方差分析表

4 討論

色素增多性皮膚病臨床最常見(jiàn)的有黃褐斑、老年斑、雀斑等，屬中醫(yī)學(xué)“黧黑斑”“面塵”“面黑皯”等范疇。目前中西醫(yī)尚無(wú)具有確切療效的良藥?！皻庋Ш停荒軜s于面部皮膚而生色斑”（《本草綱目》），臨床選藥當(dāng)辨證論治。祛斑中藥組方是本課題組治療色素增多性皮膚病的常用驗(yàn)方，方中當(dāng)歸、山楂、山萸肉等滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血活血，臨床治療黃褐斑療效確切，前期研究亦證實(shí)山楂、當(dāng)歸、山萸肉等藥（“斑白”搽劑主成分）高、中、低3個(gè)不同濃度對(duì)酪氨酸酶活性均有很強(qiáng)的抑制作用[1-3]。因而，本研究根據(jù)中醫(yī)理論及前期研究結(jié)果，繼續(xù)采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性，并運(yùn)用數(shù)學(xué)模型“析因設(shè)計(jì)法”剖析方中具有抑制酪氨酸酶活性的主效應(yīng)中藥，結(jié)果表明各藥的酪氨酸酶活性抑制率依次為山萸肉＞當(dāng)歸＞山楂，山萸肉的貢獻(xiàn)處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用（＜0.05），是方中酪氨酸酶活性抑制的主效應(yīng)中藥。

祛斑中藥組方臨床治療色素增多性皮膚病的優(yōu)勢(shì)為其作用的多途徑、多環(huán)節(jié)，不能單靠酪氨酸酶活性抑制模型來(lái)篩選脫色劑，還應(yīng)根據(jù)色素生成的許多環(huán)節(jié)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[7-8]。黑素生成過(guò)程是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，該過(guò)程除與酪氨酸酶相關(guān)外，還與多巴色素自動(dòng)氧化、多巴自動(dòng)氧化等因素密切相關(guān)。因此，本研究進(jìn)行了多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素、多巴自動(dòng)氧化試驗(yàn)的研究，以深入剖析祛斑中藥干預(yù)黑素合成的主效應(yīng)中藥。結(jié)果顯示，各藥對(duì)多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素的抑制作用依次為當(dāng)歸＞山萸肉＞山楂，當(dāng)歸、山萸肉的貢獻(xiàn)處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，對(duì)多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素具有明顯抑制作用（＜0.01），是方中抑制多巴色素自動(dòng)氧化生成黑素的主效應(yīng)中藥；各藥對(duì)多巴自動(dòng)氧化反應(yīng)的抑制依次為當(dāng)歸＞山萸肉＞山楂×山萸肉＞山楂＞當(dāng)歸×山萸肉，當(dāng)歸、山萸肉的貢獻(xiàn)處于絕對(duì)主導(dǎo)地位，對(duì)多巴自動(dòng)氧化的抑制明顯（＜0.05），是方中抑制多巴自動(dòng)氧化的主效應(yīng)中藥。

中藥復(fù)方的效果是多靶點(diǎn)、多途徑、多系統(tǒng)藥理效應(yīng)的綜合表現(xiàn)。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用析因設(shè)計(jì)與藥效相結(jié)合的方法，進(jìn)一步明確了祛斑中藥在治療色素增多性皮膚病方面的主效應(yīng)中藥或組合，研究結(jié)果從某種程度上印證了這一理論。正是由于中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑、多系統(tǒng)的作用特點(diǎn)，必然存在不同作用途徑的主要中藥，圍繞這一思路，采用析因設(shè)計(jì)法逐步明晰中藥復(fù)方綜合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)于中藥復(fù)方配伍的現(xiàn)代詮釋具有重要意義。

[1] 張理平,張海燕,李孝棟,等.28味中藥酸性成分提取物影響黑素合成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(11)：1443-1445.

[2] 陳志春,王英豪.地骨皮總黃酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究[J].福建中醫(yī)藥,2012,43(4)：54-56.

[3] 張理平.“斑白”搽劑中微量元素與氨基酸的含量及祛斑機(jī)理[J].光明中醫(yī),2004,19(6)：57-58.

[4] 張理平,陳麗,胡筱,等.外用中藥斑白搽劑對(duì)黑色素產(chǎn)生過(guò)程中酪氨酸酶的抑制作用[J].中國(guó)臨床康復(fù),2005,9(10)：168-169.

[5] 胡良平,郭辰儀.用SAS軟件實(shí)現(xiàn)析因設(shè)計(jì)定量資料的統(tǒng)計(jì)分析[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2011,11(3)：170-173.

[6] 王英豪,陳志春,張理平,等.響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹黃酮超聲輔助提取工藝及對(duì)酪氨酸酶活性抑制研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(2)：93-97.

[7] 張海霞,梁乃龍.黃褐斑與酪氨酸酶活性的相關(guān)性研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,12(9)：99-100.

[8] 鄒宏超,付香蓮.黃褐斑病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].皮膚病與性病, 2010,32(4)：27-29.

Research on Main Effective Chinese MateriaMedica inPrescription for Intervention in Melanin Synthesis

CHEN Zhi-chun1, WANG Ying-hao2, ZHANG Li-ping2, LAN Ming-jin2

Objective To investigate the major effective Chinese materia medica inPrescription for intervention in melanin synthesis. Methods 3×2 factorial design was used. The factors of investigation were Crataegi Fructus, Angelicae Sinensis Radix and Corni Fructus. Tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa were determinated respectively; and the major effective Chinese materia medica ofPrescription for intervention in melanin synthesis was analyzed by SPSS16.0 software. Results Tyrosinase activity was remarkably inhibited by Corni Fructus (<0.05). Melanin generation was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.01). Auto-oxidation of dopa was remarkably inhibited by Corni Fructus and Angelicae Sinensis Radix (<0.05). Corni Fructus was in an absolute leading position. Conclusion Corni Fructus is the major effective Chinese materia medica in inhibiting tyrosinase activity, melanin generation and auto-oxidation of dopa in the prescription.

factorial design; tyrosinase; melanin;Prescription; effective Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.020

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0086-04

福建省自然科學(xué)基金（2013J01377）

王英豪，E-mail：wyhtcm@aliyun.com

（2016-11-16）

（2016-12-09；編輯：陳靜）