王君麗， 韓 冰， 李小莉， 張丹丹

南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院呼吸內(nèi)科，深圳 518100

全反式維甲酸對哮喘小鼠氣道炎癥及輔助性T細胞17/調節(jié)性T細胞功能的影響*

王君麗， 韓 冰， 李小莉， 張丹丹

南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院呼吸內(nèi)科，深圳 518100

目的 研究全反式維甲酸對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及輔助性T細胞17(Th17)/調節(jié)性T細胞(Treg)細胞功能的調節(jié)作用。方法 采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)建立支氣管哮喘小鼠模型，分別用全反式維甲酸及潑尼松干預治療15 d(1次/d)，同時設立正常組及模型組。觀察各組小鼠肺組織的炎癥改變、細胞計數(shù)及肺泡灌洗液中IL-17、IL-10及TGF-β的含量。結果 潑尼松[7.5 mg/(kg·d)]組及全反式維甲酸高劑量[10 mg/(kg·d)]組肺部炎癥改變較模型組明顯減輕，全反式維甲酸低劑量[5 mg/(kg·d)]組炎癥反應介于模型組及潑尼松組之間。模型組肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞計數(shù)均明顯高于正常組；經(jīng)潑尼松及高劑量全反式維甲酸干預后，細胞計數(shù)均明顯下降，維甲酸低劑量組也呈下降趨勢。模型組及全反式維甲酸低劑量組IL-17含量明顯高于正常組，IL-10及TGF-β含量均低于正常組；而潑尼松組及全反式維甲酸高劑量組與正常組之間差異無統(tǒng)計學意義。與模型組相比，潑尼松組及全反式維甲酸高、低劑量組IL-17含量明顯降低，IL-10及TGF-β的含量升高。潑尼松組及全反式維甲酸高劑量組各細胞因子之間無明顯差異；與全反式維甲酸高劑量及潑尼松組相比，全反式維甲酸低劑量組IL-17含量升高，而IL-10及TGF-β含量降低。結論 全反式維甲酸可以通過調節(jié)Th17/Treg的細胞功能，從而改善哮喘小鼠的氣道炎癥反應，為治療支氣管哮喘提供新的干預措施。

支氣管哮喘； 輔助性T細胞17； 調節(jié)性T細胞； 維甲酸

支氣管哮喘是最常見的呼吸道慢性疾病之一，目前依然不能得到根治，給患者和社會造成沉重的醫(yī)療負擔，嚴重影響患者生活質量。研究表明，輔助性T細胞17(Th17)可能是引起支氣管哮喘激素抵抗的重要因素，調節(jié)性T細胞(Treg)在支氣管哮喘患者體內(nèi)數(shù)量減少，功能受到抑制。全反式維甲酸可通過影響Th17/Treg平衡，改善牙周炎及炎癥性腸病等疾病，但對支氣管哮喘Th17/Treg平衡失調的調節(jié)作用，國內(nèi)外尚未見報道。我們建立支氣管哮喘小鼠模型，研究全反式維甲酸對哮喘小鼠氣道炎癥及Th17/ Treg細胞功能的調節(jié)作用，以期為臨床治療哮喘提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物：SPF級健康雌性Balb/c小鼠60只，購于南京大學模式動物研究所，6～8周齡，體重18～22 g。藥物及試劑：全反式維甲酸片(山東良福制藥)，醋酸潑尼松片(山東新華制藥)，氫氧化鋁粉末(廣東一力集團制藥股份有限公司)，卵清蛋白(OVA)(華中海威基因科技有限公司)，小鼠IL-17、IL-10(Sigma-aldrich公司)、TGF-β(Thermo Fisher公司)ELISA試劑盒，蘇木精-伊紅(HE)染液(上海博谷生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 60只Balb/c小鼠按區(qū)組隨機法分成5組，分別為正常組、模型組、潑尼松組、全反式維甲酸低劑量組、全反式維甲酸高劑量組，每組12只。

1.2.2 哮喘小鼠模型建立 參照McMillan等[1]于2004年發(fā)表的小鼠哮喘模型制作方法并加以改良，采用OVA腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)。除正常組外，其余每組小鼠均于第1天腹腔內(nèi)注射150 μL OVA懸液(100 mL生理鹽水加入20 mg OVA及2.25 g氫氧化鋁粉末，搖勻過夜)進行致敏，第14天重復致敏1次，第28天開始，以含1% OVA的PBS溶液通入霧化吸入箱，5 min后放入造模小鼠，霧化1 h進行激發(fā)，每天1次，連續(xù)激發(fā)5 d，正常組小鼠以生理鹽水代替OVA懸液。

1.2.3 給藥 各組小鼠均于第28天給予霧化1 h后，開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)15 d。按照人和動物用藥比例換算，潑尼松組給藥量7.5 mg/(kg·d)，全反式維甲酸給藥量5 mg/(kg·d)(低劑量組)及10 mg/(kg·d)(高劑量組)。正常組和模型組每天以等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.4 標本制備 最后一次給藥結束后24 h，在全麻下，剪開胸骨，暴露胸腔，結扎右主支氣管，行左側支氣管肺泡灌洗，分3次注入PBS溶液，每次0.4 mL，回收率大于85%為合格，獲支氣管肺泡灌洗液(BALF)。離心后，上清用于細胞因子測定，細胞沉渣PBS溶液重懸后測定細胞總數(shù)，瑞氏染色后，光學顯微鏡下計數(shù)200個白細胞，根據(jù)形態(tài)學特點進行分類計數(shù)。所有小鼠取右上肺組織浸入10%中性甲醛溶液中固定24 h，進行脫水及石蠟包埋，切片后即行HE染色觀察肺組織的形態(tài)。

1.2.5 IL-17、TGF-β、IL-10含量的測定 用ELISA法測定BALF上清中IL-17、TGF-β、IL-10含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 全反式維甲酸對哮喘小鼠氣道炎癥的調節(jié)作用

2.1.1 HE染色結果 觀察各組小鼠的肺組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)：正常組小鼠氣道上皮形態(tài)正常，管腔光滑，氣道及周圍血管組織無明顯炎性細胞浸潤，氣道平滑肌未見增厚；模型組小鼠氣道上皮不完整，氣道黏膜水腫明顯，氣道及血管周圍組織可見大量的炎性細胞浸潤，管腔縮小，甚至完全閉塞，可見炎性分泌物，氣管平滑肌明顯增厚；潑尼松組及全反式維甲酸高劑量組可見輕度炎癥改變，全反式維甲酸低劑量組炎癥反應介于模型組及潑尼松組之間(圖1)。

2.1.2 細胞計數(shù) 在各組BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞計數(shù)也得到了與HE染色一致的結果。模型組各細胞計數(shù)均明顯高于正常組；維甲酸高劑量組、維甲酸低劑量組及潑尼松組各細胞計數(shù)明顯少于模型組；維甲酸高劑量組與潑尼松組無明顯差異，而維甲酸低劑量組則明顯高于維甲酸高劑量組和潑尼松組。以上差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，結果如表1所示。

2.2 各組BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量

檢測各組小鼠BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量，結果表明：模型組及全反式維甲酸低劑量組IL-17含量明顯高于正常組，IL-10及TGF-β含量均低于正常組(均P<0.01)；而潑尼松組及全反式維甲酸高劑量與正常組之間無明顯差異。與模型組比較，潑尼松組及全反式維甲酸高、低劑量組IL-17含量明顯降低，IL-10及TGF-β的含量升高(P<0.05，P<0.01)。潑尼松組及全反式維甲酸高劑量組各細胞因子之間比較差異無統(tǒng)計學意義。與全反式維甲酸高劑量及潑尼松組相比，全反式維甲酸低劑量IL-17含量升高，而IL-10及TGF-β含量降低(P<0.05，P<0.01)。結果如表2所示。

A：正常組；B：模型組；C：潑尼松組；D：全反式維甲酸高劑量組；E：全反式維甲酸低劑量組圖1 各組肺組織蘇木精-伊紅染色(×100)Fig.1 HE stain of lung tissue in each group(×100)

組別細胞總數(shù)嗜酸性粒細胞中性粒細胞正常組55.71±13.720.94±0.326.64±2.37模型組122.98±23.17**31.94±7.75**20.42±4.51**潑尼松組68.81±13.02##2.94±1.73##6.63±2.15##全反式維甲酸高劑量69.61±23.12##3.47±1.77##8.49±2.29##全反式維甲酸低劑量90.58±14.30**##△△▲▲15.33±4.78**##△△▲▲14.23±3.58**##△△▲▲F值25.426114.47544.099P值<0.01<0.01<0.01

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與潑尼松組比較，△△P<0.01；與維甲酸高劑量組比較，▲▲P<0.01

組別IL-17IL-10TGF-β正常組11.18±3.7453.99±17.1220.27±7.14模型組29.56±8.92**22.82±6.44**6.58±2.97**潑尼松組11.93±5.14## 49.75±19.44##21.83±7.95##全反式維甲酸高劑量13.61±6.44## 55.77±24.56##21.70±8.64##全反式維甲酸低劑量18.84±8.33**##△ 33.36±14.02**△▲▲13.12±4.60**#△△▲▲F值15.0898.23012.287P值<0.01<0.01<0.01

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05##P<0.01；與潑尼松組比較，△P<0.05△△P<0.01；與維甲酸高劑量組比較，▲▲P<0.01

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的呼吸道慢性疾病之一，隨著全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)指南的推廣，哮喘的防治較前取得了很大的進展，但依然不能得到根治，部分患者對現(xiàn)有的治療方案反應性差，給患者和社會造成了沉重的醫(yī)療負擔，嚴重影響患者生活質量。這一現(xiàn)狀促使我們對哮喘的干預措施作進一步的研究，從而找到新的治療方法。

我們選用全反式維甲酸干預支氣管哮喘小鼠，眾所周知，全反式維甲酸是體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，全反式維甲酸通過其受體發(fā)揮生物學效應，誘導人免疫調控轉錄因子FOXP3的表達，下調IL-17的表達，調節(jié)Th17 /Treg平衡，調控機體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸激動劑AM80可顯著下調牙周炎小鼠牙周組織和局部淋巴結中IL-17A mRNA的表達水平，上調Treg細胞相關因子IL-10和TGF-β1mRNA的表達水平，并得以改善牙周炎[2]。維甲酸還可通過其受體影響Th17/Treg平衡，從而影響炎癥性腸病的進程[3]。研究表明，維生素A制劑在體外可以調節(jié)兒童哮喘患者Th17/Treg細胞的功能[4]。

我們的實驗結果表明，經(jīng)過全反式維甲酸干預的小鼠，HE染色觀察炎癥反應及炎癥細胞浸潤等指標，均與潑尼松組無明顯差異，說明全反式維甲酸干預可以減輕哮喘小鼠氣道的炎癥反應，這一結論與之前的研究結果類似[5]。但我們的實驗設置了2種全反式維甲酸濃度，高濃度的全反式維甲酸[10 mg/(kg·d)]干預得到了與潑尼松組無差異的結果，低濃度[5 mg/(kg·d)]組雖可抑制氣道炎癥，但明顯弱于潑尼松組及高濃度組，說明全反式維甲酸的調節(jié)作用與劑量呈正相關趨勢。

為了進一步明確全反式維甲酸改善哮喘小鼠氣道炎癥的作用機制，我們檢測了各組小鼠BALF中IL-17、IL-10及TGF-β的含量，結果表明，哮喘小鼠較正常組IL-17含量明顯升高，而IL-10及TGF-β的含量明顯降低，IL-17、IL-10及TGF-β分別是Th17及Treg細胞的主要效應因子，說明在哮喘小鼠中，確實存在Th17/Treg功能的紊亂。相較模型組，潑尼松組及全反式維甲酸高、低劑量組IL-17含量明顯降低，而IL-10及TGF-β的含量明顯升高，說明全反式維甲酸具有上調Treg細胞，同時抑制Th17功能的作用。

支氣管哮喘發(fā)病機制比較復雜，Th1/Th2細胞失衡在支氣管哮喘發(fā)病中的重要作用已明確[6]，但并不能完全解釋支氣管哮喘，研究證實Th17及調節(jié)性T細胞及其代表性細胞因子IL-17、IL-10等在免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起到重要作用，如類風濕性關節(jié)炎[7]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[8]、支氣管哮喘[9-10]等疾病，我們的前期研究也得到了相似的結果[11]。另外，Th17細胞的異常很可能與激素抵抗型哮喘(SRA)的發(fā)生密切相關，Th17細胞通過分泌IL-17介導中性粒細胞炎癥，從而在支氣管哮喘的發(fā)病中起作用，而中性粒細胞性哮喘作為一種非Th2相關性哮喘是SRA的重要類型，故Th17可能是引起支氣管哮喘激素抵抗的重要因素。調節(jié)性T細胞(Treg)作為機體的重要負調節(jié)機制，研究表明，在支氣管哮喘患者體內(nèi)Treg細胞不僅數(shù)量減少，功能也受到抑制[12]，Treg細胞可以抑制哮喘患者氣道的炎癥反應，并可以抑制Th17過度的抗原提呈反應。我們的前期研究也表明，在支氣管哮喘患者外周血中確實存在Th17及Treg細胞的免疫紊亂[13]，由此可見，糾正Th17/Treg的平衡紊亂在SRA中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸可以減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，可能與其調節(jié)哮喘小鼠Th17/Treg的細胞功能有關。

綜上所述，我們的研究表明全反式維甲酸可能通過調節(jié)Th17/Treg的細胞功能，從而改善哮喘小鼠的氣道炎癥反應，這將為治療支氣管哮喘，尤其是激素抵抗性哮喘提供新的干預措施。

[1] McMillan S J，Lloyd C M.Prolonged allergen challenge in mice leads to persistent airway remodelling[J].Clin Exp Allergy，2004，34(3)：497-507.

[2] 王琳源，關寧，林曉萍，等.全反式維甲酸對牙周炎小鼠輔助性T17細胞和調節(jié)性T細胞及細胞相關因子表達的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2014，43(7)：606-611.

[3] Conway T F，Hammer L，F(xiàn)urtado S，et al.Oral delivery of particulate transforming growth factor beta 1 and all-trans retinoic acid reduces gut inflammation in murine models of inflammatory bowel disease[J].J Crohns Colitis，2015，9(8)：647-658.

[4] 柏翠，于曉峰，王芳，等.維生素A制劑對支氣管哮喘患兒外周血輔助性T淋巴細胞17和調節(jié)性T淋巴細胞功能的影響[J].中華實用兒科臨床雜志，2016，31(9)：675-678.

[5] 金紅芳，王宏偉.全反式維甲酸抗支氣管哮喘大鼠氣道炎癥的作用及機制[J].中華結核和呼吸雜志，2004，27(4)：67-68.

[6] Rogala B，Bozek A，Gluck J，et al.Prevalence of IgE-mediated allergy and evaluation of Th1/Th2 cytokine profiles in patients with severe bronchial asthma[J].Postepy Dermatol Alergol，2015，32(4)：274-280.

[7] Alunno A，Manetti M，Caterbi S，et al.Altered immunoregulation in rheumatoid arthritis：the role of regulatory T cells and proinflammatory Th17 cells and therapeutic implications[J].Mediators Inflamm，2015，2015：751793.

[8] Talaat R M，Mohamed S F，Bassyouni I H，et al.Th1/Th2/Th17/Treg cytokine imbalance in systemic lupus erythematosus(SLE)patients：Correlation with disease activity[J].Cytokine，2015，72(2)：146-153.

[9] Tao B，Ruan G，Wang D，et al.Imbalance of peripheral Th17 and regulatory T cells in children with allergic rhinitis and bronchial asthma[J].Iran J Allergy Asthma Immunol，2015，14(3)：273-279.

[10] Tian M，Wang Y，Lu Y，et al.Effects of sublingual immunotherapy for Dermatophagoides farinae on Th17 cells and CD4(+)CD25(+)regulatory T cells in peripheral blood of children with allergic asthma[J].Int Forum Allergy Rhinol，2014，4(5)：371-375.

[11] 王君麗，徐彥飛，李小莉，等.Th17/Treg細胞在支氣管哮喘患者外周血中的表達[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2016，13(24)：117-119.

[12] Chary A V，Hemalatha R，Murali M V，et al.Association of T-regulatory cells and CD23/CD21 expression with vitamin D in children with asthma[J].Ann Allergy Asthma Immunol，2016，116(5)：447-454，e2.

[13] Pandiyan P，Younes S A，Ribeiro S P，et al.Mucosal regulatory T cells and T helper 17 cells in HIV-associated immune activation[J].Front Immunol，2016，7：228.

(2017-03-07 收稿)

Effects of All Trans Retinoic Acid on Airway Inflammation and Th17/Treg Cell Function in Asthmatic Mice

Wang Junli，Han Bing，Li Xiaolietal

DepartmentofRespiration，ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity，Shenzhen518100，China

Objective To investigate effect of all trans retinoic acid (at-RA) on airway inflammation and Th17/regulatory T cell (Treg) function in asthmatic mice.Methods Bronchial asthma mouse model was established by sensitazation with intraperitoneal injection and stimulation with aerosol inhalation.The mice were treated with at-RA and prednisone for 15 days(once per day)，respectively.In addition to that，normal group and model group were established.Inflammation changes，cell counts and IL-17，IL-10 and TGF-β levels in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were observed in each group.Results Pulmonary inflammation was significantly allevated in prednisone group[7.5 mg/(kg·day)]and high dose at-RA group[10 mg/(kg·day)]as compared with model group.Inflammation of low dose at-RA group[5 mg/(kg·day)]was between that of modle group and prednisone group.Cell counts and IL-17，IL-10 and TGF-β levels in BALF were significantly higher in model group than in normal group.The cell count significantly descended in prednisone and high dose at-RA groups.Cell count also decreased in low dose at-RA group，but it was still higher than that in prednisone and high dose at-RA groups.In the model group and low dose at-RA group，the content of IL-17 was significantly increased while the content of IL-10 and TGF-β was significantly reduced as compared with the control group.And there was no significant difference between the prednisone group，high dose at-RA group，and normal group.Compared with the normal group，the content of IL-17 was significantly reduced while the content of IL-10 and TGF-β was significantly increased in prednisone group，high and low dose at-RA groups.There were no significant differences in cytokines between the prednisone group and high dose at-RA group.Compared with the prednisone group and high dose at-RA group，the content of IL-17 was significantly increased while the content of IL-10 and TGF-β was significantly reduced in low dose at-RA group.Conclusion At-RA can improve the airway inflammatory response of asthmatic mice by regulating the cellular function of Th17/Treg，thus providing new interventions for the treatment of bronchial asthma.

bronchial asthma； Th17； regulatory T cells； retinoic acid

*廣東省深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研資助項目(No.201605021)

R562.25

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.014

王君麗，女，1982年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：wangjunli0110@163.com