曹越盛，郭英雪，于 蓮，周 實(shí)，平 洋

(1.佳木斯市中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒的藥代動力學(xué)和體外對肝癌細(xì)胞生長研究①

曹越盛1，郭英雪2，于 蓮2，周 實(shí)2，平 洋2

(1.佳木斯市中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：采用高效液相色譜法研究黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征，觀察黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在體外對肝癌細(xì)胞生長影響。 方法：采用大鼠尾靜脈注射給藥，測定不同時間點(diǎn)大鼠體內(nèi)的血藥濃度。采用CCK-8法測定黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液體外抑制Hep G-2細(xì)胞的生長情況。結(jié)果：黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液和黃芩苷溶液組在大鼠體內(nèi)均符合藥動學(xué)二室模型(權(quán)重系數(shù)為1/C2)，且黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液組平均AUC0-t=350.751μg/mL，t1/2=5.983h，baicalin溶液組AUC=231.178μg/mL，t1/2beta=4.434h，黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液在體內(nèi)的絕對生物利用度為163.394%。結(jié)論：黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液在大鼠體內(nèi)具有緩釋作用，且黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液體外對Hep G-2細(xì)胞的生長有抑制作用，并且抑制作用強(qiáng)于黃芩苷溶液組。

黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒；藥代動力學(xué)；體外抗腫瘤

黃芩苷(baicalin, C21H18O11)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。具有多種藥理作用，如降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、利膽、抗菌、消炎等，臨床證明其抗菌抗炎作用確切，主要用于感染性肝炎、肺炎等疾病[1～5]。由于黃芩苷的親水性和親油性較差，經(jīng)口服給藥后，藥物在腸道的吸收不完全，導(dǎo)致其生物利用度差，進(jìn)而限制了黃芩苷在臨床上的應(yīng)用。因此通過改變劑型增加體內(nèi)的吸收并提高生物利用度。目前國內(nèi)外許多從事藥物研發(fā)的工作者對黃芩苷的藥理、藥效等作用研究已經(jīng)十分深入，已發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗菌抗病毒、清除氧自由基、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管及神經(jīng)元、保肝、預(yù)防或治療糖尿病及其并發(fā)癥等作用[6～9]，肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，病程隱匿，病死率高，容易產(chǎn)生耐藥[10～13]，使肝癌治療很不理想，導(dǎo)致治療失敗和預(yù)后不佳。本研究將繼續(xù)對黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒(BSLNs)的體內(nèi)藥動學(xué)進(jìn)行研究，并考察BSLNs體外抑制肝癌細(xì)胞作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀工作站(日本島津公司)；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；FA2004N-電子分析天(上海恒平科技有限公司)；XW-80A旋渦混合器(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；371型-CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)TECAN sunrise光吸收酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 試藥

黃芩苷原料藥(諸城市浩天藥業(yè)有限公司，含量85%)；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(天津一方科技有限公司，含量98%，批號10081418)；卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，含量99.7%，批號10014-201004)；黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒(自制)；黃芩苷原料藥(諸城市浩天藥業(yè)有限公司，含量85%)； CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；PS(Hyclone)；0.25%胰酶(Hyclone)；PBS(Hyclone)其他溶劑或試劑均為色譜純級別。

1.3 動物及細(xì)胞

SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，SCXK(遼)2008-0002)，體重(200±20)g；Hep G-2人肝癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

色譜條件: Agilent C18色譜柱(4.6mm ×250mm，5 μm)； 流動相：甲醇-水-磷酸(55:45:0.2)；流速：1mL·min-1；紫外檢測波長279nm；柱溫：室溫； 進(jìn)樣量：10μL；內(nèi)標(biāo)：卡馬西平。

對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液配制: 精密稱取黃芩苷對照品10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇定容，配制成濃度為100μg/mL的黃芩苷對照品溶液。分別精密吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10mL容量瓶中，甲醇定容，得到濃度分別為3～50μg/mL系列濃度的對照品溶液。

精密稱取內(nèi)標(biāo)物卡馬西平10mg，甲醇溶液定容于100mL容量瓶中，配成濃度為100μg/mL的卡馬西平溶液。精密吸取1mL于100mL容量瓶中，配制濃度為10μg/mL卡馬西平甲醇溶液備用。

動物分組及給藥方案: SD大鼠8只隨機(jī)分成兩組，即黃芩苷溶液組和黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒溶液組，大鼠禁食12h后尾靜脈注射給藥，劑量為大鼠體重30mg/kg，分別于給藥后0.25、0.5、1、2、2.5、4、5、6、8、12h眼眶取血2mL于肝素鈉抗凝管中，14000r/min

離心10min分離血漿，-18℃凍存。

血漿樣品處理及測定: 取大鼠血漿0.5mL，分別加入內(nèi)標(biāo)物50μL、乙腈0.5mL，渦旋1min，14000r/min離心10min，取上清液水浴揮干(55-60℃)。殘渣用300μL流動相溶解，進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖及峰面積。

方法專屬性考察: 分別吸取2份空白血漿樣品0.5mL，一份按“血漿樣品處理”項操作，HPLC測定并記錄色譜圖；另一份空白血漿樣品中加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品50μL和內(nèi)標(biāo)物卡馬西平50μL，處理方法同上，HPLC測定并記錄色譜圖；再取給藥后血漿樣品0.5mL，處理方法同上，HPLC測定并記錄色譜圖。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制: 精密吸取若干份空白血漿，每份0.5mL，分別加入50μL濃度為3～50μg/mL的黃芩苷甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成含不同濃度黃芩苷的血漿樣品溶液，按“血漿樣品處理”項操作，HPLC測定，以樣品中黃芩苷的濃度為橫坐標(biāo)，黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制血漿樣品中黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度考察: 取9份空白血漿，每份0.5mL，分別加入5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL，渦旋混合1min，配制成3個不同濃度的血漿樣品，每個濃度3份，按“血漿樣品處理”項進(jìn)行操作，每隔10min HPLC測定，代入黃芩苷血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算日內(nèi)精密度。

回收率試驗(yàn): 取3份大鼠空白血漿0.5mL，分別加入高、中、低黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL，渦旋混合1min，按“血漿樣品處理”項進(jìn)行操作，HPLC測定，記錄黃芩苷與內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計算峰面積比值，并代入血漿標(biāo)準(zhǔn)方程中算濃度，以測得濃度與實(shí)際加入濃度的比計算方法回收率。

HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng): HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含90%RPMI-1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%PS。放于5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。

CCK-8實(shí)驗(yàn)方法: 取對數(shù)生長期HepG-2細(xì)胞按1×105/mL，接種于96孔板內(nèi)，每個濃度設(shè)定3個復(fù)孔，放于5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，向每孔中加入不同濃度的baicalin溶液和BSLNs溶液，對照組加等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h后每孔加入 CCK-8 溶液放于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，酶標(biāo)儀450nm測定各孔的吸光度值，并計算各組對HepG-2細(xì)胞生長抑制率。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性考察

在選定的色譜條件下，黃芩苷出峰時間為7.5min，內(nèi)標(biāo)物出峰時間為10.8min，黃芩苷與內(nèi)標(biāo)物分離較好，在樣品處理過程中未引入干擾性雜質(zhì)，因此在此色譜條件下，黃芩苷測定無干擾。見圖1～3。

圖1 空白血漿

圖2 空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)

圖3 血漿樣品

圖4 HPLC法測定血樣中黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

血漿樣品中黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0066x-0.0215, R=0.9972，在線性范圍為3～50μg/mL，線性關(guān)系良好，見圖4。

2.2. 方法學(xué)考察

見表1～3。

表1 血漿樣品中測得黃芩苷精密度

日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，日內(nèi)精密度高，符合體內(nèi)藥物分析要求。

表2 血漿樣品中測得黃芩苷回收率

表2說明黃芩苷在血漿中的方法回收率達(dá)到體內(nèi)藥物分析要求。藥物濃度-時間曲線和藥動學(xué)參數(shù)大鼠體內(nèi)血漿藥物濃度-時間曲線見圖5。將BSLNs樣品溶液組和baicalin溶液組的血藥濃度結(jié)果用“藥動學(xué)計算程序3P97”擬合，求動力學(xué)參數(shù)，見表3。

圖5 大鼠尾靜脈注射黃芩苷溶液和黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒注射液后藥-時曲線(n=3)

表3 大鼠尾靜脈注射后動力學(xué)參數(shù)

圖5可知BSLNs樣品溶液組的藥-時曲線下面積大于baicalin溶液組藥-時曲線下面積，說明BSLNs在大鼠體內(nèi)吸收效果好于baicalin溶液。由表3中數(shù)據(jù)可知BSLNs和baicalin溶液在體內(nèi)藥動模型均符合二室模型，權(quán)重系數(shù)為1/C2 ；BSLNs在體內(nèi)的消除半衰期t1/2beta=5.983h，baicalin溶液的消除半衰期t1/2beta=4.434h，說明BSLNs樣品溶液在大鼠體內(nèi)的停留時間長于baicalin溶液，說明BSLNs具有緩釋作用；BSLNs樣品溶液組AUC=350.751，baicalin溶液組AUC=231.178，說明BSLNs在體內(nèi)的吸收作用強(qiáng)于baicalin溶液；BSLNs樣品溶液組在體內(nèi)清除率CL=0.171，baicalin溶液組CL=0.260，相比baicalin溶液組 BSLNs樣品溶液組在體內(nèi)的清除率降低，再次說明BSLNs緩釋作用效果明顯。

2.3 生物利用度

絕對生物利用度，說明固體脂質(zhì)納米粒這種劑型提高了黃芩苷在體內(nèi)生物利用度。

2.4 CCK-8法體外抑制Hep G-2細(xì)胞生長

見圖6～8。

圖6 12h HepG-2細(xì)胞體外抑制率

圖7 24h HepG-2細(xì)胞體外抑制率

圖8 48h HepG-2細(xì)胞體外抑制率

由圖6～8可以看出baicalin組對HepG-2細(xì)胞生長的抑制率隨著時間的延長抑制率逐漸減弱， 24h后僅42μg/mL和37.5μg/mL兩個濃度對HepG-2細(xì)胞生長有抑制作用，且抑制率不足20%，其余濃度均對HepG-2細(xì)胞沒有抑制作用。BSLNs組對HepG-2細(xì)胞生長的抑制率明顯高于baicalin組，有效濃度在16.7～42μg/mL，且高濃度范圍33.3～42μg/mL BSLNs組對HepG-2細(xì)胞生長的抑制作用隨著時間的延長，24h時抑制率最高，可以達(dá)到76.7%；中濃度范圍16.7～25μg/mL BSLNs組對HepG-2細(xì)胞生長的抑制率隨著時間的延長呈上升趨勢，且在48h抑制率為72.4%。說明BSLNs組對抑制HepG-2細(xì)胞的生長情況優(yōu)于baicalin組。BSLNs較baicalin抑制HepG-2細(xì)胞生長作用強(qiáng)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對BSLNs進(jìn)行了體內(nèi)藥動學(xué)和體外抗肝癌細(xì)胞活性研究，采用反相高效液相色譜法測定血漿樣品中黃芩苷藥物濃度，結(jié)果BSLNs樣品溶液在大鼠體內(nèi)吸收效果高于baicalin溶液；血藥濃度-時間數(shù)據(jù)擬合結(jié)果可知BSLNs樣品溶液和baicalin溶液在大鼠體內(nèi)均符合藥動學(xué)二室模型，且BSLNs樣品溶液組平均AUC0-t和t1/2均高于baicalin溶液組，說明BSLNs在體內(nèi)的吸收利用度較baicalin溶液組好，并且在體內(nèi)具有明顯的緩釋作用，BSLNs在體內(nèi)的絕對生物利用度為163.394%。CCK-8法體外抑制HepG-2細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，BSLNs樣品溶液組的體外抑制癌細(xì)胞生長作用效果明顯高于baicalin溶液，這既符合黃芩苷的藥理作用，也說明固體脂質(zhì)納米粒這種劑型能夠保證黃芩苷最大作用發(fā)揮療效，當(dāng)然也為將來BSLNs對體內(nèi)抗腫瘤作用研究提供理論基礎(chǔ)。

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Study of pharmacokinetic and anti liver cancer cells effect of baicalin solid lipid nanoparticles in vitro

CAOYue-sheng1,GUOYing-xue2,YULian2,ZHOUShi2,PINGYang2

(1.Department of Pharmacy, Central Hospital of Jiamusi City, Jiamusi 154002,China;2.College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To investigate the pharmacokinetics of baicalin solid lipid nanoparticals (BSLNs) in rats by HPLC method, and the inhibitory effect of BSLNs on the Hep G-2 cells. Method: By intravenous administration, the concentration of baicalin in blood plasma at different time points were determined. Human Hep G-2 cells were treated with BSLNs, and the effects on cells inhibition were investigated by CCK-8 cell viability assay. Result: The study of pharmacokinetics of BSLNs and baicalins-sol in rats showed that the two preparations were fitted with two-compartment model; and pharmacokinetic results showed that the mean AUC0-t of BSLNs group was 350.751μg/mL, t1/2is 5.983h, while the AUC=231.178μg/mL, t1/2beta=4.434h. (Weighting factor is1/C2). The absolute bioavailability was 163.394%. Conclusion: BSLNs group shows a significant sustained-release in vivo. Then BSLNs shows a greater effect on inhibiting the growth of Hep G-2 cells compared with baicalins-sol group.

baicalin solid lipid nanoparticals;pharmacokinetics;anti-tumor in vitro

佳木斯大學(xué)校級科研項目，編號：S2014-016。

曹越盛(1985～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，藥師。

平洋(1986～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail：18245482328@163.com。

R285.5；R735.7

A

1008-0104(2017)03-0053-04

2016-12-20)