陳 曦,李英英，宋鐵英

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建，福州 350003)

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乳酸菌對豆粕發(fā)酵中特定菌群與多肽水平的影響

陳 曦,李英英，宋鐵英

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建，福州 350003)

微生物發(fā)酵是改善豆粕營養(yǎng)成分的有效手段，但發(fā)酵進(jìn)程中微生物水平的變化和相關(guān)影響尚缺乏足夠研究。通過添加外源乳酸菌(屎腸球菌)，研究豆粕72 h發(fā)酵進(jìn)程內(nèi)，菌群和蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示，無論是否添加外源乳酸菌，豆粕中的總菌水平均呈三段式下降。相反，豆粕中的乳酸菌水平成增長趨勢，且外源添加對這一趨勢具有明顯的提速(時(shí)間縮短1倍)和增效(1.3倍)作用。在蛋白水平的變化上，上述兩組豆粕在粗蛋白和游離氨基酸的時(shí)間變化趨勢上未有明顯差別，但在多肽水平的變化趨勢上差別顯著。添加乳酸菌組豆粕發(fā)酵生成的多肽含量更高，且生成的速度更快(時(shí)間縮短1倍)，此趨勢與豆粕中乳酸菌的增長趨勢相對應(yīng)，表明乳酸菌的添加促進(jìn)了豆粕中蛋白水解為多肽，但水解不足以產(chǎn)生大量游離氨基酸。

乳酸菌；豆粕發(fā)酵；菌群水平；多肽；氨基酸

豆粕指以大豆為原料，提取油脂后的碎片狀或粗粉狀副產(chǎn)品[1]。豆粕中必需氨基酸含量較高、蛋白成分組成合理、平衡，是魚類和單胃動物很好的植物性蛋白源[2]。但大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相對分子質(zhì)量高，大豆蛋白消化率和生物效價(jià)不高，并且蛋白溶解度較低，無法直接作為功能性成分在食品和飼料中加以利用[3]。添加微生物對豆粕進(jìn)行發(fā)酵，從而產(chǎn)生相應(yīng)的大豆多肽，被證實(shí)是解決上述問題的有效手段[4]。在動物飼養(yǎng)試驗(yàn)上的大量研究表明，多肽的吸收比蛋白質(zhì)及游離氨基酸更快、更多[5]，并可促進(jìn)對礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[6]，提高機(jī)體免疫力，因此具有十分廣闊的開發(fā)利用前景[7]。然而，目前對于微生物豆粕發(fā)酵的研究多集中在抗?fàn)I養(yǎng)因子去除和發(fā)酵后的營養(yǎng)水平方面，對于豆粕發(fā)酵中微生物的總菌和特征菌群的數(shù)量變化，及微生物對多肽水平的影響，目前尚未完全明確。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，已經(jīng)構(gòu)建了飼料添加類益生菌的菌種庫，其中以屎腸球菌(EnterococcusFaecium)為代表的乳酸菌，被證實(shí)對于豬的腸道微生態(tài)和生長性能具有正向調(diào)節(jié)作用。本研究以此為基礎(chǔ)，通過在豆粕中添加該株乳酸菌進(jìn)行半固體發(fā)酵，探討外源乳酸菌在發(fā)酵進(jìn)程中，對于豆粕原有微生物總體數(shù)量及乳酸菌數(shù)量的影響，并與豆粕主要營養(yǎng)成分的改變情況進(jìn)行關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究微生物在豆粕發(fā)酵中的機(jī)理機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究豆粕中添加的屎腸球菌(EnterococcusFaecium)菌株來自本實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)時(shí)添加的活菌濃度為7×108CFU/ml。所使用的豆粕購于福建省華龍飼料有限公司，粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.6%，水分為6.3%。

1.2 發(fā)酵參數(shù)

試驗(yàn)采用單因素水平處理，以時(shí)間(0～72 h)為梯度變量，每12 h為一個(gè)梯度，分別設(shè)置試驗(yàn)組(添加屎腸球菌)和對照組(不添加屎腸球菌)，豆粕、水和菌液按照1∶ 0.9∶ 0.1的比例混合均勻后，于密封袋中37℃下恒溫厭氧發(fā)酵。

1.3 指標(biāo)測定

通過16S 細(xì)菌rDNA 實(shí)時(shí)熒光PCR法，測定豆粕中總菌和乳酸菌的數(shù)量變化。每份樣品取0.1 g，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書提供的方法提取DNA，熒光定量PCR所用SYBR Premix Ex Taq(Tli RnaseH Plus)按試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書進(jìn)行；所用特異引物設(shè)計(jì)按參考文獻(xiàn)[8,9]所述設(shè)計(jì)(見表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。測得3個(gè)重復(fù)的數(shù)據(jù)后進(jìn)行平均。

豆粕成分變化主要測定水分、粗蛋白質(zhì)、游離氨基酸和多肽。水分和粗蛋白質(zhì)含量按參考文獻(xiàn)[10]中方法測定；游離氨基酸和多肽含量按參考文獻(xiàn)[11]中方法測定。

表1 所用引物序列與擴(kuò)增片段長度

2 結(jié)果和分析

2.1 豆粕發(fā)酵進(jìn)程中微生物變化情況

如圖1所示，兩組發(fā)酵豆粕在初始總菌水平上極為接近，豆粕中總菌水平隨著時(shí)間變化呈下降趨勢，并可分為3個(gè)階段，即在0～24 h內(nèi)顯著降低，24～60 h內(nèi)的緩慢波動和60 h后的再次降低(圖1a)。相反，兩組豆粕中乳酸菌水平隨時(shí)間呈現(xiàn)整體上升態(tài)勢，其中試驗(yàn)組和對照組略有不同：實(shí)驗(yàn)組呈0～24 h內(nèi)的顯著上升，24～48 h內(nèi)的緩慢上升和48 h后的緩慢下降的三段式波動(圖1b),而對照組的乳酸菌水平呈0～48 h內(nèi)顯著上升和48～72 h的緩慢上升的兩段式增長。

圖1 兩組發(fā)酵豆粕中總菌和乳酸菌隨發(fā)酵時(shí)間變化情況

2.2 豆粕發(fā)酵中主要成分和營養(yǎng)物質(zhì)隨時(shí)間變化規(guī)律

2.2.1 發(fā)酵豆粕水分和粗蛋白質(zhì)變化情況

從圖2中可以看出，無論是實(shí)驗(yàn)組還是對照組，在72 h豆粕發(fā)酵過程中，其中的水分見圖2a，總的粗蛋白質(zhì)含量見圖2b，均并無明顯改變。

2.2.2 發(fā)酵豆粕中游離氨基酸和多肽隨時(shí)間變化情況

如圖3所示，兩組豆粕在發(fā)酵過程中，游離氨基酸含量見圖3a，隨時(shí)間變化有小幅波動，幅度分別僅為0.16%(試驗(yàn)組)和0.13%(對照組)，差異并不顯著。相反，兩組豆粕在發(fā)酵中的多肽含量(圖3b)出現(xiàn)了顯著變化，其中，試驗(yàn)組多肽含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的狀況，其中,0～12 h為波動期，在12～36 h呈現(xiàn)顯著上升，36～72 h呈現(xiàn)平緩上升，于72 h達(dá)到最高值(1.5%)，此峰值為初始(0.5%)的3倍。對照組的趨勢略有不同：于0～48 h呈現(xiàn)波動，于48～72 h顯著上升，未出現(xiàn)平緩上升的趨勢，峰值水平同樣位于72 h(1.4%)，為初始含量(0.54%)的2.6倍。

3 討論

研究表明，豆粕發(fā)酵不僅能降低豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子，更重要的是能夠通過有益微生物及其產(chǎn)物，改善豆粕的適口性，提高營養(yǎng)品質(zhì)，輔助提高腸道免疫力[3]。因此，豆粕中微生物的變化情況，直接關(guān)系著豆粕的飼料效率和營養(yǎng)價(jià)值[12]。從本研究的結(jié)果中可以看出(圖1)，隨著時(shí)間變化，發(fā)酵豆粕中的總菌數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢，兩組豆粕總菌水平在0～24 h(特別是12～24 h區(qū)段)內(nèi)出現(xiàn)顯著下降，極有可能與厭氧環(huán)境逐漸形成，占菌群優(yōu)勢比例的好氧菌大量減少有關(guān)，因此半固體發(fā)酵時(shí)豆粕內(nèi)部形成的厭氧環(huán)境，可抑制某些微生物的長期生長。在添加了外源乳酸菌后，試驗(yàn)組在該階段內(nèi)乳酸菌大量增長進(jìn)而成為優(yōu)勢菌群，彌補(bǔ)了上述情況，使得試驗(yàn)組的總菌水平相對較高(圖1a)。

與總菌不同，兩組豆粕中的乳酸菌在增長趨勢上相似，但在增長速度上明顯不同(圖1b)。對照組乳酸菌水平，在0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)指數(shù)增長，之后雖進(jìn)入平緩期，但未在試驗(yàn)期內(nèi)出現(xiàn)下降，說明對照組豆粕內(nèi)環(huán)境的乳酸菌容量尚未達(dá)到飽和值。與對照組相比，試驗(yàn)組乳酸菌的增長速度明顯更快，其在(0～24 h)內(nèi)即完成指數(shù)增長，并在48 h后出現(xiàn)了水平下降，說明此豆粕內(nèi)環(huán)境的乳酸菌含量已達(dá)飽和。該峰值水平為5.1×109CFU/g，高于先期的類似報(bào)道[13,14]。此外，試驗(yàn)組乳酸菌的峰值水平，較發(fā)酵初期增加了40倍，高于對照組的30倍。上述結(jié)果說明，外源添加對于豆粕發(fā)酵中乳酸菌活菌的生長，不僅具有增速(時(shí)間縮短1倍)作用，也具有增效(1.3倍)作用。

在蛋白質(zhì)成分方面，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是自身的微生物還是外源添加的乳酸菌，均未對豆粕的粗蛋白質(zhì)和水分水平產(chǎn)生明顯影響。該結(jié)果說明在封閉的厭氧環(huán)境下，豆粕自有微生物群落和外源乳酸菌及其產(chǎn)物，均無法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖分、脂類等其他物質(zhì)，發(fā)酵反應(yīng)更多的可能是對大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行降解。

多肽的含量變化情況證實(shí)了上述推論。在本試驗(yàn)中，兩組豆粕在游離氨基酸含量變化上相差不大，該結(jié)果與前人研究[15,16]相符，但多肽的含量則分別提高了3倍(試驗(yàn)組)和2.6倍(對照組)，說明在豆粕發(fā)酵中，乳酸菌和豆粕自身菌群主要通過將蛋白質(zhì)水解為小分子多肽而改變蛋白成分結(jié)構(gòu)，而且外源添加對這種水解有促進(jìn)作用(3倍與2.6倍)，但水解的程度不深，未足以大量產(chǎn)生游離氨基酸。另外，需要指出的是，試驗(yàn)組的多肽水平在0～36 h后已接近峰值(圖3b),快于對照組達(dá)到峰值所需的72 h。兩組豆粕上述多肽水平的變化趨勢均與相應(yīng)乳酸菌水平的變化(圖1b)相符合。上述結(jié)果說明無論是否添加外源菌種，豆粕中的乳酸菌均有助于蛋白質(zhì)水解生成多肽，而添加外源乳酸菌除對多肽在生成水平上有促進(jìn)外，最為主要的是增速作用(時(shí)間縮短1倍)。

4 結(jié)論

在72 h的發(fā)酵過程中，豆粕發(fā)酵所產(chǎn)生的厭氧環(huán)境可抑制某些微生物的長期生長，從而造成總菌水平的下降和乳酸菌水平的增長。添加外源乳酸菌對于總菌的下降有彌補(bǔ)作用，而對于乳酸菌的增長有明顯的增速和增效作用。兩組豆粕在水分、粗蛋白質(zhì)、游離氨基酸等水平的波動上均未有明顯差異，但多肽的含量卻明顯上升，且添加外源乳酸菌對于多肽的產(chǎn)生也具有增效和顯著的增速作用，并在變化趨勢上與乳酸菌的增長情況相對應(yīng)。此結(jié)果說明，乳酸菌有助于豆粕蛋白水解生成多肽，但水解不足以產(chǎn)生大量游離氨基酸。

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(責(zé)任編輯：舒蓮梅)

我國將以科技創(chuàng)新推進(jìn)“中國好糧油”行動

作為農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的重要內(nèi)容，我國將大力推廣普及糧食科技，推進(jìn)優(yōu)質(zhì)糧油基地建設(shè)，加快糧油產(chǎn)品提質(zhì)升級，以“中國好糧油”行動引導(dǎo)糧油健康消費(fèi)。

由國家糧食局、中國科協(xié)、食品藥品監(jiān)管總局、全國婦聯(lián)共同舉辦的2017年糧食科技活動周21日拉開帷幕。以“發(fā)展糧油科技、增加優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品、保障主食安全”為主題，此次活動期間將按“好種子、好原料、好儲藏、好加工、好產(chǎn)品、好主食”的糧食產(chǎn)業(yè)鏈條，在安徽、河南、江蘇、湖南、廣東等地舉辦系列活動。全國還將開展“中國好糧油”科普進(jìn)校園、進(jìn)企業(yè)、進(jìn)軍營，把生產(chǎn)和消費(fèi)優(yōu)質(zhì)糧油理念傳遞給廣大生產(chǎn)者、經(jīng)營者和消費(fèi)者，以進(jìn)一步凝聚共識，推動糧油消費(fèi)提檔升級。

(XHS,2017-05-22)

Influence on the level of bacteria amount and polypeptides by the lactic acid bacteria in soybean meal fermentation

CHEN Xi,LI Ying-ying,SONG Tie-ying

(Biotechnology Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

Although fermentation was one of the best ways to improve the nutrition of the soybean meal,the change of the bacteria and their influences on the fermentation process were inadequately clarified.The soybean meal was investigated on the level of the bacteria and the protein during the fermentation in 72 h with/without the addition of the lactic acid (LAB)EnterococcusFaecium.The results showed that the total bacteria account decreased in 3-step style,no matter whether the LAB was added or not.In contrast，the level of LAB in soybean meal increased during the fermentation,and was strengthened at rate by 100% and at amount by 130% through the addition of extra LAB.With the respect of the protein level,two groups of soybean meal had no significant differences at the changes of crude protein and free amino acid,but were quite different at the changes of polypeptides.The production of the polypeptides in the group with extra LAB were shown to be more efficient at both of the level and rate (by 100%).These changes of the polypeptides were similar to the LAB changing in two groups,indicating that the production of polypeptides but not the free amino acid was improved by the addition of extra LAB.

lactic acid bacteria;soybean meal fermentation;bacteria amount;polypeptides

2017-04-20；

2017-04-28

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目-省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1019-9、2017R1019-2、2017R1019-7)；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-N-106)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目(2014CX-11)。

陳 曦(1982-)，男，助理研究員，主要從事動物營養(yǎng)和免疫研究。

宋鐵英(1963-)，女，研究員，主要從事動物營養(yǎng)和免疫研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.06.012

S816.43+1;S816.6

A

1003-6202(2017)06-0046-04