吳軍 孫剛 董朝 馬斌林

·論著·

BRIP1基因多態(tài)性在維族、漢族婦女早發(fā)性乳腺癌的分布狀況分析

吳軍 孫剛 董朝 馬斌林

目的 觀察新疆維吾爾族、漢族婦女早發(fā)性乳腺癌BRCA1相互作用蛋白1(BRIP1)基因外顯子突變情況。方法 直接測序法檢測新疆維吾爾族與漢族婦女早發(fā)性乳腺癌(年齡30～40歲，各80例)BRIP1基因外顯子區(qū)域。結(jié)果 (1)維族：rs4986765的基因型分布在孕激素受體陽性、陰性間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。rs4986764、rs4986763與Ki-67有一定相關(guān)性(均為)，其突變型攜帶者可分別增加乳腺癌中Ki-67≥15%型發(fā)病風(fēng)險(OR=9.000)。rs4986764、rs4986763在有、無惡性腫瘤家族史組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。rs4986764、rs4986763基因型分布在初潮年齡<14歲、≥14歲組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，初潮年齡≥14歲的乳腺癌突變型攜帶率高于初潮年齡<14歲。(2)漢族：BRIP1基因rs4986765、rs4986764、rs4986763位點基因型分布與所研究的臨床病理特征均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 在新疆維吾爾族早發(fā)性乳腺癌中，BRIP1基因多態(tài)性與初潮年齡、惡性腫瘤家族史、孕激素受體、Ki-67有相關(guān)性；但漢族早發(fā)性乳腺癌無相關(guān)性。

早發(fā)性乳腺癌； 維吾爾族； BRIP1基因； 單核苷酸多態(tài)性

基因在人類多種腫瘤中有著重要的作用[1]，對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移起著負性調(diào)節(jié)的作用[2]。據(jù)估計，5%～10%乳腺癌由顯著遺傳傾向引起[3]，一些家族風(fēng)險由高外顯率易感基因引起，特別是BRCA1和BRCA2[4]，但是這兩個基因突變占所有乳腺癌患者的比例<5%，占家族性癌癥的比例不到25%[5]。有研究表明，在沒有BRCA突變的家庭發(fā)生乳腺癌可能由低外顯率等位基因引起[6]。BRCA1相互作用蛋白1(BRIP1)，是一種DNA解旋酶，它影響DNA修復(fù)能力和BRCA1的抑癌功能，基于其與BRCA1基因的相互作用，該BRIP1基因被認為是一個潛在的乳腺癌易感基因[7-9]。我們展開了針對新疆維吾爾族、漢族婦女早發(fā)性乳腺癌(年齡30～40歲)BRIP1基因檢測，研究其攜帶及分布特點，為進一步篩選乳腺癌高危人群提供相關(guān)的理論依據(jù)。

對象與方法

一、對象

我院年齡30～40歲的維族女性早發(fā)性乳腺癌患者80例(初治)，術(shù)前未接受放療、化療，并排除其他惡性腫瘤，按照年齡匹配，同期收集我院住院治療的漢族女性乳腺癌80例(初治)，均無親緣關(guān)系，術(shù)后均經(jīng)病理切片證實。收集惡性腫瘤家族史、月經(jīng)初潮史、病理報告等詳細臨床信息。入組患者均簽署B(yǎng)RIP1基因檢測知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

二、方法

1.DNA提?。翰杉軝z者空腹外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。用血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)，按照試劑盒說明書從5 ml外周血中提取基因組DNA。

2.設(shè)計引物及PCR反應(yīng)：共設(shè)計了26對引物擴增了26個片段，覆蓋了該基因20個編碼外顯子和啟動子2 kb。引物用在線Primer 3軟件設(shè)計，由上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心合成，建立PCR反應(yīng)體系。

3.DNA測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶和外切酶I純化后用ABI公司的BigDye3.1試劑盒測序，在ABI3130上樣，測序文件用Polyphred軟件分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗；BRIP1基因多態(tài)性與臨床、病理的相關(guān)性采用χ2檢驗，計算P值、相對危險度(odd ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidenceinterval，CI)。雙側(cè)檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 維、漢族BRIP1基因外顯子位點發(fā)生突變結(jié)果及功能預(yù)測

注：Polyphen預(yù)測分值>0.9表示：很可能影響蛋白質(zhì)功能，SIFT預(yù)測分值<0.05表示：影響蛋白質(zhì)功能。S：同義突變；M：錯義突變，F(xiàn)：移碼突變。CEU為歐洲人群，CHB為中國北方漢族人群，MAF：最小等位基因頻率。

表2 維族早發(fā)性乳腺癌與BRIP1基因外顯子區(qū)高頻多態(tài)位點相關(guān)性分析

注：aFisher的精確概率值，括號內(nèi)為%。針對檢測出的高頻率位點與乳腺癌進行相關(guān)性分析

表3 漢族早發(fā)性乳腺癌與BRIP1基因外顯子區(qū)高頻多態(tài)位點相關(guān)性分析

注：aFisher的精確概率值，括號內(nèi)為%。針對檢測出的高頻率位點與乳腺癌進行相關(guān)性分析

結(jié) 果

1.BRIP1基因突變檢測：(1)用直接測序法對BRIP1基因外顯子區(qū)域進行突變檢測，共檢測出9個突變位點(表1)，包括5個錯義突變、2個同義突變和2個缺失突變，分別位于EXON6、EXON9 、EXON19和EXON20。其中，維族人群中檢測到4個位點突變，漢族有9個位點突變。(2)Polyphen和SIFT軟件預(yù)測蛋白質(zhì)功能(表1)：維、漢早發(fā)性乳腺癌患者共有的突變位點rs4986764、漢族突變位點c.2593C>T均為有害突變，可能影響B(tài)RIP1蛋白質(zhì)的功能。

2.BRIP1基因多態(tài)性與病理特征的相關(guān)性：(1)維吾爾族乳腺癌見表2。 在孕激素受體(PR)分層分析中，發(fā)現(xiàn)rs4986765位點野生型、顯性模型(突變型攜帶者)在PR陰性與PR陽性組間分布存在差異(P<0.05)。在Ki-67分層分析中，rs4986764、rs4986763與維族早發(fā)性乳腺癌Ki-67有一定相關(guān)性，其野生型TT、顯性模型(TC+CC)分布在Ki-67<15%、≥15%組間存在差異(均為P<0.01)，其突變型攜帶者可分別增加維族乳腺癌患者中Ki-67≥15%型發(fā)病風(fēng)險9倍(OR=9.000，95%CI：2.151～37.659)。(2)漢族乳腺癌見表3。BRIP1基因rs4986765、rs4986764、rs4986763位點基因型分布與PR、Ki-67均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.BRIP1基因多態(tài)性與臨床特征的相關(guān)性：(1)維吾爾族乳腺癌見表2。①在惡性腫瘤家族史分層分析中，rs4986764、rs4986763與維族早發(fā)性乳腺癌家族史有一定相關(guān)性，其野生型TT、顯性模型(TC+CC)分布在有、無惡性腫瘤家族史組間存在差異(均為P<0.01)。②rs4986764、rs4986763基因型分布在維族乳腺癌初潮年齡<14歲、≥14歲分組中的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，初潮年齡≥14歲的乳腺癌患者突變型攜帶率高于初潮年齡<14歲的乳腺癌。(2)漢族乳腺癌見表3。BRIP1基因rs4986765、rs4986764、rs4986763位點基因型分布與惡性腫瘤家族史、初潮年齡均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

討 論

BRIPl/BACHl基因跨度180 kb，包括20個外顯子，編碼1249個氨基酸的蛋白質(zhì)，它被定位于染色體17q22上，而BRCA1位于17q21上[10]。BRIP1基因突變已被證明與乳腺癌的風(fēng)險相關(guān)[11]，但是存在種族和地域的差異性。

本實驗共檢測出9個突變位點，其中2個缺失突變分別為MUTATION(c.2990_2993del，EXON20)、MUTATION(c.2992_2995del，EXON20)，缺失突變造成氨基酸讀碼框順序的改變，并產(chǎn)生新的終止密碼子，使蛋白發(fā)生截短，造成功能缺失。De Nicolo等[12]對BRCA1/BRCA2突變陰性的乳腺癌進行BRIP1基因突變檢測，在BRIP1外顯子20中亦發(fā)現(xiàn)4個核苷酸的缺失(c.2992～2995 delAAGA)，進一步研究表明BRIP1缺失突變(2992-2995delAAGA)的重組蛋白具有降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和減少與BRCA1相互作用的能力。本試驗對BRIP1外顯子20上的c.2992_2995del缺失突變患者進行臨床分析，發(fā)現(xiàn)此患者患病年齡較早(39歲)，且有惡性腫瘤家族史。

增殖細胞核抗原ki67蛋白可作為乳腺癌化療的敏感性指標，它充分的反應(yīng)了腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，ki67蛋白表達下降越明顯，化療效果也就越肯定[13]。本次試驗發(fā)現(xiàn)rs4986764、rs4986763位點的突變型攜帶者可分別增加維族乳腺癌患者中Ki-67≥15%型發(fā)病風(fēng)險9倍，說明這兩個位點的顯性模型可能對乳腺癌Ki-67高表達產(chǎn)生促進作用，這種有害作用增加了腫瘤侵襲力，因此，上述兩個位點可能對預(yù)測乳腺癌的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。

維族與漢族乳腺癌比較，平均發(fā)病年齡早，激素受體狀況也存在差異[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs4986763、rs4986764(Ser919Pro)位點的野生型TT、顯性模型(TC+CC)分布在維族早發(fā)性乳腺癌家族史、初潮年齡組間均存在差異，rs4986765位點野生型、顯性模型在PR陰性與PR陽性組間分布存在差異，說明rs4986765位點可能與PR陽性乳腺癌的關(guān)系更為密切，由于樣本量不夠大，分層分析后無法對rs4986765位點與PR的相對危險度進一步分析。

上述結(jié)果表明，BRIP1基因多態(tài)性位點與新疆維吾爾族早發(fā)性乳腺癌中PR、Ki-67、乳腺癌家族史、初潮年齡有相關(guān)性，而且rs4986764位點的蛋白功能預(yù)測與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致均為有害突變，可能對進一步臨床研究有指導(dǎo)意義。

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(本文編輯：楊澤平)

Distribution analysis of BRIP1 gene polymorphism between Uygur and Han nationality women with earlyonset breast cancer

WUJun，SUNGang，DONGChao，etal.

(DepartmentofBreastandHead-NeckSurgicalOntology，AffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective To observe gene exon mutation of BRCA1 interacting protein 1(BRIP1) in Xinjiang Uygur and Han nationality women with early onset breast cancer.Method Exon region of BRIP1 gene were detected via direct sequencing in Xinjiang Uygur and Han nationality women with early onset breast cancer(age：30～40 years old，separately 80 cases).Results (1)In Uighur：There was a significant difference of the frequencies between the genotype of rs4986765 among the PR(-)and PR(+)(P<0.05);There was a certain correlation between the mutation sites(rs4986764 and rs4986763)and the Ki-67(P<0.01)，and the mutants could increase the breast cancer patients，risk of Ki-67≥15% subtype(OR=9.000);There were differences in rs4986764 and rs4986763 genotypes among Family history of cancer and non-cancer(P<0.01).There were differences in rs4986764 and rs4986763 genotypes among menarche age<14 and ≥14(P<0.05)，The mutant carrying rate in Menarche age at≥14 of breast cancer patients was higher than the menarche age at<14 years of breast cancer patients.(2)In Han nationality，There were not statistically significant BRIP1 gene in rs4986765，rs4986764 and rs4986763 locus genotypes with clinicopathological characteristics studied(P>0.05).Conclusion Among early-onset breast cancer in Xinjiang women of Uygur nationality，there was a certain correlation between BRIP1 gene polymorphism and menarche age、Family history of cancer、PR and Ki-67，There may instructive to further clinical studies，But there was no correlation between the early-onset breast cancer of Han nationality.

early onset breast cancer； Uighur； BRIP1 gene； single nucleotide polymorphism(SNP)

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.04.014

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(2016D01C348)

830011 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺頭頸外科/新疆腫瘤防治研究所

馬斌林，Email：mbldoctor@126.com

2016-11-25)