瀕危藥材金線蓮愈傷組織誘導及分化成苗研究

許晴 穆梁麗 冀愛青

摘要[目的]建立有效的瀕危藥材金線蓮的再生體系，為其工廠化生產奠定技術基礎。[方法]選取福建金線蓮的葉片、莖片、帶節(jié)莖段、不定芽為外植體，建立無菌體系，而后以愈傷組織的誘導率為指標，采用正交設計優(yōu)化不同外植體各階段（愈傷組織的誘導和分化）培養(yǎng)基中激素的種類及濃度。[結果]在試驗的福建金線蓮4種外植體中，不定芽的愈傷組織誘導率最高，可達96.67%，其最適培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT。在此培養(yǎng)基上，誘導的愈傷組織在分化培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA和增殖培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上繼代形成了無根試管苗。[結論]該研究建立的無菌繁殖體系，解決了前人所指出的金線蓮愈傷組織誘導率極低的瓶頸問題，組培成苗的效率有較大提高。

關鍵詞金線蓮；不定芽；愈傷組織；分化成苗

中圖分類號S567.23+9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0103-04

Abstract[Objective] The research aimed to establish an effective recycling system for Anoectochilus roxburghii， and lay the technical foundation for its industrial production. [Method] As explant of leaf， stem， stem segment with node and adventitious bud of Anoectochilus roxburghii， the aseptic system was established， and then the induction rate of callus was used as an index to optimize the type and concentration of hormones in the culture medium of different explants （callus induction and differentiation） by orthogonal design.[Result]In the test of Anoectochilus roxburghii， four explants， the callus induction rate of adventitious bud was the highest， up to 96.67%， the optimum medium formula was MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT. On the basis of the medium， the callus was subcultured on the differentiation medium（MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） and the proliferation medium （MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） to form a rootless test tube.[Conclusion]Asepsis reproductive system has been established， which solves the bottleneck problem that the predecessors pointed out that the callus induction rate of Anoectochilus roxburghii was very low，the efficiency of tissue culture seedlings have greatly improved.

Key wordsAnoectochilus roxburghii；Adventitious buds；Callus；Seeding differentiation

金線蓮[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl]，別名金絲線、金耳環(huán)等，蘭科開唇蘭屬多年生草本植物。金線蓮是我國珍稀瀕危的名貴藥材，素有“藥中之王”之稱，其全草均可入藥，有清熱涼血、祛風利濕、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效。近年來，金線蓮在治療高血壓、糖尿病及腫瘤等疑難病癥方面日益引起醫(yī)藥界的重視，具有廣闊的開發(fā)利用前景。金線蓮的種子不易萌發(fā)，用傳統的實生繁殖相當困難，且其栽培對生態(tài)環(huán)境要求嚴格，加之自然環(huán)境遭受嚴重破壞，生長極其緩慢，且蟲鳥等動物喜食，自然資源稀少，導致市場價格昂貴，高達3 000～5 000元/kg，不利于金線蓮的推廣。而植物組織培養(yǎng)技術作為一種無性繁殖的手段，可在短期內提供大量優(yōu)質的試管苗，使其大面積推廣成為可能。目前，金線蓮的快速繁殖主要通過原球莖和叢生芽進行培養(yǎng)物的大量繁殖[1-6]，而對愈傷組織的研究卻鮮見報道。因為莖段受腋芽影響不能大量擴增，并且外植體的數目也有限，光靠原球莖和叢生芽進行組織快繁遠不能滿足市場需求。利用愈傷組織來培養(yǎng)可以對植物進行快速繁殖，同時，也對植物改良、種質保存有很大作用，這樣使得金線蓮的繁殖速度得到了最大化的提升。該試驗采用金線蓮的不同組織（葉片、莖片、莖段及不定芽）作為外植體材料，通過愈傷誘導、分化、繼代、生根4個階段培養(yǎng)，形成大量優(yōu)良試管苗，為金線蓮的規(guī)?；a提供可靠的技術保障。

1 材料與方法

1.1供試材料選擇生長旺盛、無病蟲害的健壯金線蓮植株，摘取葉片、莖作為供試外植體材料。

1.2材料處理軟毛刷刷凈葉片、莖段、不定芽材料表面，放入小燒杯中罩上紗布后，流水沖洗30 min左右，置于超凈工作臺上，在75%酒精中浸泡30 s后，倒去酒精，再用0.1%HgCl2滅菌8 min，無菌水沖洗5～7次。將葉片切成0.5 cm2左右小塊，莖段切成1 cm左右小段和2 mm左右厚度的薄片，不定芽切下即可，無菌條件下接入準備好的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每瓶接4～6個外植體。

1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法以MS為基本培養(yǎng)基，以蔗糖30 g/L為碳源，用瓊脂4.2 g/L固化，pH調至5.8附加不同濃度水平的植物激素。分裝后，在121 ℃下濕熱滅菌20 min，放入無菌操作室。用SPSS軟件對6-BA、NAA、KT 3個因素多個濃度水平進行正交設計，并計算出誘導率：愈傷組織誘導率= 誘導愈傷組織數/接種外植體數×100%。

1.4培養(yǎng)條件溫度22～26 ℃，光照時數12 h/d，光照強度2 000 lx。

2結果與分析

2.1金線蓮葉片誘導愈傷組織從表1可以看出，正交設計的三因素三水平的9個處理均未誘導出愈傷組織。

2.2金線蓮莖片誘導愈傷組織從表2可以看出，正交設計的三因素三水平的9個處理愈傷組織誘導率不同，其中處理5誘導率最高，達13.33%。根據極差分析得知，影響金線蓮莖片誘導愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.3金線蓮莖段誘導愈傷組織從表3可以看出，正交設計的三因素三水平的9個處理愈傷組織誘導率明顯不同，其中處理5誘導率最高，達54.44%。根據極差分析得知，影響金線蓮莖段誘導愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.4金線蓮不定芽誘導愈傷組織從表4可以看出，正交設計的三因素三水平的9個處理愈傷組織誘導率存在顯著差異，其中處理5誘導率最高，達96.67%。根據極差分析得知，影響金線蓮不定芽誘導愈傷組織最重要的激素為NAA，且最適配比為NAA（2）+BA（2）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。由圖1可知，不定芽接種在最適培養(yǎng)基中13 d，不定芽開始膨脹擴張，出現瘤狀結構的小突起，呈奶黃色，有光澤；不定芽接種在最適培養(yǎng)基25 d，瘤狀突起不斷擴大增加，形成大塊的愈傷組織，顏色呈青綠色，其頂部可見的球狀的乳白色突起；經過反復繼代后，愈傷組織逐漸變小，4～5代后愈傷組織質地松散，透明。

2.5金線蓮不定芽愈傷組織分化成苗將不定芽愈傷組織切塊接到不同的分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，一段時間后觀察發(fā)現愈傷組織切塊邊緣出現不同數量的棕紅色芽點，第16天芽點地方長成小芽（圖2a），小芽繼續(xù)生長發(fā)育形成小苗（圖2b），然后將無根試管苗在增殖培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上繼代移栽（圖3）。

3結論與討論

采用葉片、莖段、莖片及不定芽4種不同外植體誘導愈傷組織，發(fā)現不定芽的愈傷組織誘導率最高，可達96.67%，其次為莖段和莖片，最高誘導率分別達54.44%和13.33%；而葉片并未誘導出愈傷組織。其不定芽、莖段、莖片誘導愈傷組織較適的培養(yǎng)基分別為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA、0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

在以往的關于金線蓮組織培養(yǎng)的研究中，原球莖及叢生芽誘導的報道較多，但以不同外植體誘導愈傷組織則鮮見報道。該試驗得出采用不定芽作為外植體比葉片、莖段、莖片3種外植體的誘導率高，究其原因可能與不定芽在4種外植體中的分生能力最強有關，這與王雅英等[3]的研究結果一致。該試驗中，葉片并未誘導出愈傷組織，且研究僅限于愈傷組織的誘導、分化方面，在植株生根及愈傷組織誘導培養(yǎng)基優(yōu)化等方面還有待進一步研究。

參考文獻

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