康 鵬，張 鵬，王 宇

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100050；2.國(guó)家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050)

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臨床醫(yī)學(xué)研究

Calumenin在成人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及對(duì)U87細(xì)胞增殖與遷移的作用

康 鵬1，2，張 鵬1，2，王 宇1，2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100050；2.國(guó)家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050)

目的 檢測(cè)Calumenin在成人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)，并研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87細(xì)胞株)的細(xì)胞生物學(xué)作用。方法 收集成人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本(腫瘤組)和非腦部疾病死亡的人腦組織標(biāo)本(對(duì)照組)，RT-qPCR檢測(cè)CalumeninmRNA水平，免疫組化染色檢測(cè)Calumenin表達(dá)；利用RNAi技術(shù)在U87細(xì)胞中特異性沉默Calumenin，觀(guān)察細(xì)胞增殖及遷移變化。結(jié)果Calumenin在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，其免疫組化染色顯示Calumenin蛋白陽(yáng)性；U87細(xì)胞敲除Calumenin后，細(xì)胞增殖、遷移能力均顯著下降。結(jié)論Calumenin在人腦額葉膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤中確有表達(dá)，其對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的惡性細(xì)胞生物學(xué)特征發(fā)揮了重要作用，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新的分子生物學(xué)靶點(diǎn)。

Calumenin；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；U87；增殖；遷移

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起源于神經(jīng)外胚層的一種原發(fā)腫瘤，其致死率與致殘率均高[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2007年的腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)系統(tǒng)[2]將其分為低級(jí)別(LGC：Low Grade Glioma)和高級(jí)別(HGC:High Grade Glioma)兩大類(lèi)，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤包括I級(jí)與II級(jí)，惡性程度相對(duì)較低；高級(jí)別包括III級(jí)間變星形與IV級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。目前膠質(zhì)瘤的治療主要依賴(lài)于手術(shù)切除，術(shù)后輔助放化療，但整體預(yù)后仍不理想[3]。

鈣腔蛋白(Calumenin，CALU)是一種位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的低親和力鈣結(jié)合蛋白，與其它四個(gè)成員RCN1、RCN2、RCN3和SDF4組成CREC家族，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中表達(dá)[4-5]。既往研究顯示CALU參與多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)，包括鈣循環(huán)、血管鈣化、細(xì)胞遷移及凋亡過(guò)程。在鼠的大腦中，CALU僅在胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)，到成年時(shí)其表達(dá)量下降甚至消失[6]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示CALU在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中有表達(dá)，本研究擬對(duì)CALU在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織與U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系做進(jìn)一步的檢測(cè)，以明確其表達(dá)性質(zhì)及在腫瘤惡性度中的分子生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87)由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；Transwell 6孔板(孔徑8um)購(gòu)自Corning公司；CALU及β-actin引物、siRNA序列的設(shè)計(jì)及合成均由吉瑪公司完成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自全式金公司；MTT試劑盒、Trizol、Lipofectamine2000、DMEM、細(xì)胞培養(yǎng)試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；兔單抗-Calumenin抗體(ab137019)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab137027)購(gòu)自abcam公司；蘇木素(C6158)，購(gòu)自Sigma公司。顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自Zeiss公司。蛋白電泳系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad；熒光定量PCR儀器為Applied Biosystems? QuantStudio? 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)；SpectraMax 190光吸收型酶標(biāo)儀來(lái)自Molecular Devices公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司。

1.2 組織標(biāo)本來(lái)源 人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織(腫瘤組)來(lái)源于北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本，入組標(biāo)準(zhǔn)為：①患者年齡18～65歲；②腫瘤位于端腦；③病理類(lèi)型為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO IV級(jí))；④術(shù)前未行放化療。將術(shù)中所取的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本用PBS清洗干凈，去除血塊及壞死部分，再次用PBS緩沖液沖洗數(shù)次，保存在液氮中。對(duì)照組腦組織來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院人腦組織庫(kù)中非腦部疾病死亡的患者，其流程均按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)腦組織保存方法進(jìn)行處理與質(zhì)控[7]。此次研究符合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理要求，所有行腫瘤切除患者均知情同意。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)CALUmRNA水平 將部分腦組織標(biāo)本用勻漿器充分研磨混勻后加入TRIzol，按照其說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度與純度，電泳檢測(cè)其完整性，-80 ℃冰箱保存。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制作cDNA，簡(jiǎn)述如下。2 ug總RNA加入1 μL Olig(dT)，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、dNTP混合物2 μL、RNA酶抑制劑20單位、反轉(zhuǎn)錄酶1μL、RNase-free水至20μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。

采用SYBR Green PCR kit實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60°退火C15 s，72 ℃延伸15 s共40個(gè)循環(huán)；以β-actin作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法計(jì)算CALUmRNA的相對(duì)表達(dá)量。CALU引物：Forward 5’- CCTCAGCTCAGTGACAAGGT-3’，Reverse 5’-CTGTCGCTCTACATCCTCGT-3’；β-actin引物：Forward 5’-CATTAAGGAG AAGCTGTGCT-3’，Reverse 5’-GTTGAAGGTAGTTTCGT GGA-3’。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)CALU蛋白表達(dá) 兩組腦組織經(jīng)固定、石蠟包埋切成厚10 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將組織浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，于微波爐內(nèi)微波輻射至沸騰15 min行抗原修復(fù)，再浸泡0.3%過(guò)氧化氫10 min。PBS漂洗后用3%血清白蛋白(BSA)封閉1 h，兔抗人CALU抗體(稀釋比1∶500)4 ℃過(guò)夜。第2天用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，二氨基苯孵育顯色，蘇木素復(fù)染脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 U87細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87)使用DMEM培養(yǎng)基，輔助1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS)，在37 ℃，5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，每4～7天傳代一次。

1.6CALU-siRNA構(gòu)建與篩選 靶向人CALU的加載綠色熒光蛋白的siRNA序列由吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，包括三個(gè)候選siRNA序列及一個(gè)對(duì)照siRNA序列。CALU-siRNA-1：5’-GCGCUGGAUUUACGAGGAU-3’，anti-sense 5’-AUCCUCGUAAAUCCA GCGC-3’；CALU-siRNA-2 sense:5’-GCUCAAAGACUGGAUUAAA-3’，anti-sense 5’-UUUAAUCCAGUCUUUGAGC -3’；CALU-siRNA-3 sense 5’- GCAUGACCU CAAUGAGGAC-3’，anti-sense 5’-GUCCUCAUUGAGGUCAUGC-3’。對(duì)照序列CALU-scramble sense:5’-GCGUAGGCAUUGAGUCGAU-3’，anti-sense 5’-AUCG ACUCAAUGCCUACGC-3’。

將U87細(xì)胞以5×104個(gè)/mL種植在培養(yǎng)皿，按照所需濃度將lipofectamine 2 000分別與100 pmol siRNA進(jìn)行相應(yīng)配制，室溫下靜置30 min后加入每個(gè)培養(yǎng)皿中，24 h后通過(guò)觀(guān)察綠色熒光細(xì)胞數(shù)量占視野內(nèi)光鏡細(xì)胞比率直接計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，每孔均能達(dá)到>80%。

轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞內(nèi)加入1 mL TRIzol，按照方法1.3提取總RNA，后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算CALU的mRNA相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞用PBS漂洗后加入蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，充分震蕩，將裂解細(xì)胞收集至1.5 mL離心管，在4 ℃下12,000 g離心后取上清液。將制備好的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CALU抗體(1∶500稀釋)，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，4 ℃下過(guò)夜。TBST充分洗膜，羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST充分洗膜，滴入化學(xué)發(fā)光劑ECL，圖像分析系統(tǒng)采集分析Calumenin蛋白表達(dá)量。組間比較CALUmRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行siRNA序列篩選，確定沉默最佳的siRNA序列。

1.7 轉(zhuǎn)染CALUsiRNA后U87細(xì)胞增殖和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖用MTT試劑盒檢測(cè)，取上述轉(zhuǎn)染CALUsiRNA沉默最佳序列和對(duì)照序列的U87細(xì)胞(各5×104個(gè)/mL)分別接種到96孔板，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基100 uL。培養(yǎng)24 h、48 h和72后分別加入50 μL 1倍稀釋的MTT液，在37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO使甲月贊溶解，用平板搖床搖勻。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

取轉(zhuǎn)染CALU-siRNA沉默最佳序列與對(duì)照序列的U87細(xì)胞懸液各2 mL(5×104個(gè)/mL)分別加入Transwell小室，下室加1 mL DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。后取出下室基底膜，擦去上室內(nèi)細(xì)胞，PBS漂洗，甲醇固定30 min，蘇木素溶液行細(xì)胞核染色。遷移的細(xì)胞數(shù)量在200倍顯微鏡下觀(guān)察，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)視野。計(jì)算細(xì)胞侵襲率(%)=穿膜細(xì)胞數(shù)/上室接種的細(xì)胞總數(shù)×100%。以對(duì)照組遷移率設(shè)定為100%，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的遷移率。

2 結(jié)果

2.1CALU在人腦組織中的表達(dá) 如圖1B所示，CALU在正常腦組織中并無(wú)表達(dá)，而在手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中，免疫組化染色顯示有陽(yáng)性表達(dá)(圖1C)。通過(guò)RT- qPCR檢測(cè)兩組不同組織中CALUmRNA，結(jié)果顯示CALU在膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)是其在正常組織中的(4.971 ± 0.5012)倍(P<0.001)。

A：CALU mRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)是正常組織的4.97倍(P<0.001)；B：成人正常腦組織CALU免疫組化染色；C：成人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織CALU免疫組化染色。圖1 CALU在成人正常腦組織與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)(×40)

2.2CALU-siRNA序列的篩選 為進(jìn)一步研究CALU在膠質(zhì)瘤中的作用，本課題設(shè)計(jì)了能夠沉默CALU表達(dá)的siRNA序列。經(jīng)過(guò)篩選，如圖2所示，相對(duì)于對(duì)照序列，CALU-siRNA-2序列可將CALUmRNA降低75%以上，Western blot也證實(shí)CALUsiRNA-2序列能夠顯著降低U87細(xì)胞中的CALU蛋白表達(dá)，因此，本課題選擇CALU-siRNA-2序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A：CALU-siRNA序列轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后CALU mRNA水平，B：CALU-siRNA序列轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后CALU蛋白表達(dá)；1：空白對(duì)照；2.Scramble siRNA；3.CALU-siRNA-1；4.CALU -siRNA-2；5.CALU-siRNA-3。圖2 CALU-siRNA序列篩選

2.3CALU-siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后增殖顯著下降 將U87細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染最佳CALU-siRNA序列后每24小時(shí)測(cè)量細(xì)胞增殖率變化情況。如圖3所示，在轉(zhuǎn)染后24 h，沉默組的增殖比率已顯著小于對(duì)照組，這個(gè)現(xiàn)象在轉(zhuǎn)染后的72 h差異達(dá)到58%(P<0.001)。

2.4CALU-siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后遷移能力顯著下降 通過(guò)transwel檢測(cè)CALU-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)U87細(xì)胞遷移的影響(見(jiàn)圖4)。轉(zhuǎn)染后24 h可見(jiàn)CALU-siRNA組的遷移能力顯著小于對(duì)照組，約為后者的38.5%(P<0.001)。

*P<0.01， #P<0.001。圖3 沉默CALU后U87細(xì)胞增殖情況

A:對(duì)照組;B:CALU-siRNA組;C:沉默CALU后U87細(xì)胞遷移能力， *P<0.001。圖4 沉默CALU后U87細(xì)胞遷移情況(×40)

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種惡性腫瘤，其生存期短、致殘率高的特點(diǎn)一直困擾著醫(yī)學(xué)臨床與科研者。通過(guò)大規(guī)?；蚪M學(xué)測(cè)序，與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度相關(guān)的基因被不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)這種惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷更新與闡明?；谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)，我們通過(guò)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CALU在成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中有高表達(dá)，并且在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的分析顯示其可能直接參與到腫瘤惡性程度的機(jī)制中。

CALU是位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種低親和力鈣結(jié)合蛋白。在心臟、胎盤(pán)和骨骼肌中表達(dá)量最高，其次是在肺、腎和胃，而在大腦和肝臟中表達(dá)最少[8]。在Vasiljavic的研究中，CALU在胚胎小鼠的大腦中的表達(dá)量可與其富含的心臟相比，但此表達(dá)量隨著小鼠發(fā)育的成熟卻逐漸下降，到成年時(shí)最低，通過(guò)Western blot方法幾乎測(cè)不出來(lái)[6]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CALU在腦室周?chē)谋磉_(dá)量最高，此區(qū)域一直被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)源地[9]。在胚胎期的小鼠腦齒狀回中，陽(yáng)性表達(dá)CALU的細(xì)胞集中于NeuN陰性、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞中，證實(shí)CALU主要還是在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。值得注意的是，生理情況下CALU可以被分泌至外周血中，通過(guò)自分泌與旁分泌方式對(duì)細(xì)胞骨架起調(diào)控作用[10]，但在神經(jīng)系統(tǒng)中其作用機(jī)制仍在研究中。本研究在正常人腦組織中沒(méi)有檢測(cè)到CALU的表達(dá)，與前述動(dòng)物研究結(jié)果一致，但在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織證實(shí)了CALU的陽(yáng)性表達(dá)。Sreekanthreddy等[11]曾提示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血清中CALU的表達(dá)量明顯升高，并且與預(yù)后直接呈正相關(guān)性，這與本研究結(jié)果在一定程度上具有關(guān)聯(lián)性。本研究通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)CALU在成人正常腦組織中無(wú)表達(dá)，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中卻呈陽(yáng)性表達(dá)，故而推測(cè)CALU的表達(dá)升高在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，同時(shí)可能對(duì)患者預(yù)后有一定影響，但這個(gè)假設(shè)需要臨床隨訪(fǎng)記錄進(jìn)一步的驗(yàn)證。

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)方法我們發(fā)現(xiàn)CALU在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中mRNA表達(dá)量是其正常腦組織的近5倍。有意思的是，通過(guò)文獻(xiàn)回顧我們發(fā)現(xiàn)，CALU在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)也存在差異性，如在頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、肝細(xì)胞癌和胰腺癌[14]中其表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，而在結(jié)腸癌中卻呈高表達(dá)狀態(tài)[15]。我們推測(cè)這種差異可能與CALU在不同腫瘤組織中的作用不同有關(guān)。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)CALU具有15個(gè)不同的mRNA剪切體[16]，其在不同腫瘤組織中的差異性表達(dá)也許還與不同的剪切體變化量有關(guān)。為研究CALU缺失可能對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)CALU-siRNA序列并轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)U87細(xì)胞增殖和遷移的作用，為下一步治療靶點(diǎn)選擇實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也直接證實(shí)了U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中確實(shí)有CALU基因表達(dá)。

作為腫瘤的兩大特征，增殖與遷移能力在各項(xiàng)腫瘤研究中被廣泛評(píng)估。通過(guò)沉默CALU表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，U87細(xì)胞的增殖與遷移能力均顯著降低，這一結(jié)果提示CALU可直接影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度，但是其機(jī)制目前不清。有研究提示在肝細(xì)胞癌中CALU與Fabulin-1協(xié)同作用于細(xì)胞遷移[14]；另外的研究結(jié)果也提示CALU在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)并影響細(xì)胞遷移，在心肌肌漿網(wǎng)中，CALU可通過(guò)SERCA2來(lái)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而可能影響細(xì)胞增殖[17]。但考慮到不同腫瘤組織CALU的表達(dá)量也不同，有可能其機(jī)制不能通過(guò)前述研究來(lái)解釋。尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為不均一腫瘤，其瘤內(nèi)異質(zhì)性極大，所以CALU的作用也有可能不盡相同，這些都需要進(jìn)一步的后續(xù)研究進(jìn)行闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CALU在成人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，且細(xì)胞生物學(xué)研究顯示其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移產(chǎn)生影響，隨著對(duì)CALU的研究深入，可能為將來(lái)的基因治療或生物藥物研發(fā)提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

[1] Ostrom Q T,Gittleman P H,Farah A O,et al.CBTRUS statistical report:Primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006-2010[J].Neuro Oncol,2013,15( Suppl 2):1-56.

[2] Rousseau A,Mokhtari K,Duyckaerts C.The 2007 WHO classification of tumors of the central nervous system - what has changed? [J].Current Opinion in Neurology,2008,21(6):720-727.

[3] Stupp R,Mason W P,Van den Bent M J,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].N Engl J Med,2005,352(10):987-996.

[4] Sahoo S K,Kim D H.Characterization of calumenin in mouse heart[J].BMB Rep,2010,43(3): 158-163.

[5] Honore B.The rapidly expanding CREC protein family:members,localization,function,and role in disease[J].Bioessays,2009,31(3):262-277.

[6] Vasiljevic M,Heisler F F,Hausrat T J,et al.Spatio-temporal expression analysis of the calcium- binding protein calumenin in the rodent brain[J].Neuroscience,2012,202:29-41.

[7] 仇文穎,劉帆,楊倩,等.人腦組織庫(kù)樣本100例質(zhì)量及影響因素分析[J].解剖學(xué)報(bào),2016,47 (3):6.

[8] Vorum H,Liu X,Madsen P,et al.Molecular cloning of a cDNA encoding human calumenin,expression in Escherichia coli and analysis of its Ca2+-binding activity[J].Biochim Biophys Acta,1998,1386(1):121-131.

[9] Xie Q,Flavahan W A,Bao S,et al.The tailless root of glioma:cancer stem cells[J].Cell Stem Cell,2014,15(2):114-116.

[10] Ostergaard M,Hansen G A,Vorum H,et al.Proteomic profiling of fibroblasts reveals a modulating effect of extracellular calumenin on the organization of the actin cytoskeleton[J].Proteomics,2006,6(12):3509-3519.

[11] Sreekanthreddy P,Srinivasan H,Kumar D M,et al.Identification of potential serum biomarkers of glioblastoma:serum osteopontin levels correlate with poor prognosis[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(6):1409-1422.

[12] Wu W,Tang X,Hu W,et al.Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J].Clin Exp Metastasis,2002,19(4):319-326.

[13] Voisin S N,Krakovska O,Matta A,et al.Identification of novel molecular targets for endometrial cancer using a drill-down LC-MS/MS approach with iTRAQ[J].Plos One,2011,6(1):e16352.

[14] Wang Q,Shen B,Chen L,et al.Extracellular calumenin suppresses ERK1/2 signaling and cell migration by protecting fibulin-1 from MMP-13-mediated proteolysis[J].Oncogene,2015,34(8):1006-1018.

[15] Mikula M,Rubel T,Karczmarski J,et al.Integrating proteomic and transcriptomic high-throughput surveys for search of new biomarkers of colon tumors[J].Funct Integr Genomics,2011,11(2):215-224.

[16] Feng H,Chen L,Wang Q,et al.Calumenin-15 facilitates filopodia formation by promoting TGF-beta superfamily cytokine GDF-15 transcription[J].Cell Death Dis,2013,4:e870.

[17] Sahoo S K.Characterization of calumenin-SERCA2 interaction in mouse cardiac sarcoplasmic reticulum[J].J Biol Chem,2009,284(45):31109-31121.

[收稿2017-04-15;修回2017-05-10]

(編輯：王福軍)

Expression ofCalumeninin human glioblastoma and functional study in cellular activities in U87 cells

KangPeng1,2，ZhangPeng1,2，WangYu1,2

(1.Department of Neurosurgery,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University， Beijing 100050 ，China; 2.China National Clinical Research Center for Neurological Diseases，Beijing 100050，China)

Objective To examine the expression of Calumenin in adult human glioblastoma tissues and further investigate the cytobiological function in U87 cellsinvitro.Methods Human tissues were collected from surgically resected glioblastoma (tumor group) located or non brain diseases (control group).Quantitative real-time PCR and immunohistochemical staining were carried out to detect the expression of Calumenin in human glioblastoma (GBM) samples resected from adult frontal lobe.The phenotypic changes of U87 cells like proliferation and migration were investigated in the absence of Calumenin mediated by RNAi.Results The results showed that Calumenin mRNA level in human GBM was significantly higher by approximately 5 fold (P<0.001) than normal brain post-mortem tissue samples.The protein level was verified by immunohistochemistry in GBM tissues.After Calumenin was knocked down by RNAi,U87 MG cells manifested a significant decrease in proliferation and migration ratesinvitro.Conclusion Our data indicated that Calumenin was involved in the regulation of glioblastomainvitroand it may serve as an important potential therapeutic target for treatment.

Calumenin; glioblastoma; U87; proliferation; migration

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助(青年骨干)項(xiàng)目(NO:2015000021469G221)。

王宇，男，博士，研究方向：大腦膠質(zhì)瘤的臨床治療與分子生物學(xué)機(jī)制， E-mail:zlzxwy@sina.com。

R739.41

A

1000-2715(2017)03-0292-05