陳菲菲，姚文華*，李紅英

(1.湖北省恩施州農(nóng)科院，湖北恩施445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北恩施445000)

天然超富硒酵母XS-1發(fā)酵營養(yǎng)成分研究

陳菲菲1，2，姚文華1，2*，李紅英1，2

(1.湖北省恩施州農(nóng)科院，湖北恩施445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北恩施445000)

為獲得有較高硒含量以及得率較高的XS-1的培養(yǎng)基配方，通過單因素實驗及正交實驗，優(yōu)化實驗室已有天然超富硒酵母XS-1的培養(yǎng)基成分。結(jié)果表明，XS-1的最佳培養(yǎng)基配比為：蔗糖的總添加量為10%，牛肉膏與酵母膏的添加比例為2∶3，牛肉膏與酵母膏的總添加量為4%，MgSO4·7H2O的總添加量為0.05%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于酵母XS-1的生長。

酵母；培養(yǎng)基；優(yōu)化；硒

已有研究證明，硒與健康息息相關(guān)[1-4]。硒是動植物生長不可或缺的微量元素，亦是人體內(nèi)多種功能酶的活性中心，如谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）家族[5]、脫碘酶（ⅠD）家族[6]等，這些酶在機體抗氧化及免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用。但大量研究表明，無機硒毒性強且吸收低，而有機硒則較為安全[7]，已成為替代亞硒酸鈉的有機硒源[8，9]。近年來，有機硒作為補硒添加劑已在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。

目前，有機硒的獲得途徑主要是富硒酵母的培養(yǎng)[10]，且富硒酵母是整個硒產(chǎn)業(yè)的頂端產(chǎn)物。富硒酵母是當(dāng)前能夠通過工業(yè)途徑得到的硒含量穩(wěn)定且有機硒含量能夠達(dá)到現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的有機硒原料。同時，其產(chǎn)量能夠得到保證，能夠滿足一部分人群長期補硒的需求。

近年來，通過酵母的生物富集功能，將無機態(tài)硒轉(zhuǎn)化為有機態(tài)硒的理論及相關(guān)研究已有很多報道[11]。酵母具有較高的硒富集及硒轉(zhuǎn)化能力，在酵母細(xì)胞內(nèi)，硒元素能夠取代部分含硫氨基酸中的硫元素，即生成硒代氨基酸，并進一步得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，將無機形式的硒元素轉(zhuǎn)化為有機形式的硒，因此，富硒酵母已成為有機硒研究的熱點[12-14]。

本文針對本實驗室已有天然超富硒酵母XS-1，研究其生長過程，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，即不同碳源、氮源、無機鹽及促生長因子對該酵母富硒發(fā)酵的影響，通過單因素實驗和正交實驗分析優(yōu)化富硒發(fā)酵培養(yǎng)基條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然超富硒酵母XS-1，實驗室自篩菌。

酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘油、甘露醇、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和亞硒酸鈉（分析純）。

肉湯培養(yǎng)基：1%牛肉膏、1%蛋白胨、6%蔗糖、0.15%硫酸氫二鉀[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫振蕩培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、超菌工作臺、鼓風(fēng)恒溫烘箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 XS-1生長曲線的測定

利用肉湯培養(yǎng)基，接種現(xiàn)已保存的XS-1菌種，每2h取樣測定其吸光值（OD值），測得其生長曲線。

1.3.2 XS-1種液的制備

利用肉湯培養(yǎng)基，接種現(xiàn)已保存的XS-1菌種，發(fā)酵至對數(shù)期即可按10%的比例接種至新的培養(yǎng)基進行發(fā)酵。

1.3.3 XS-1培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

碳源主要選用蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘油和甘露醇6種糖作為碳源，添加量為6%，其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

根據(jù)結(jié)果選用最佳碳源，進行2%、4%、6%、8%和10%的梯度試驗。其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

1.3.4 XS-1培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

氮源主要選用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，添加量為2%，同時考察蛋白胨與牛肉膏（1∶1）、牛肉膏與酵母膏（1∶1）和蛋白胨與酵母膏（1∶1）3個復(fù)合氮源，總添加量為2%，其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

根據(jù)結(jié)果選用最佳碳源，進行1%、2%、3%、4%和5%的梯度試驗。其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

若復(fù)合氮源結(jié)果為最優(yōu)，需進行內(nèi)部比例實驗，2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2。其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

1.3.5 XS-1培養(yǎng)基無機鹽的優(yōu)化

無機鹽主要選用MgSO4·7H2O、CaCl2、K2HPO4，添加量為0.15%，其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

根據(jù)結(jié)果選用最佳無機鹽，進行0.05%、0.15%、0.25%、0.35%和0.45%的梯度試驗。其余成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

1.3.6 XS-1培養(yǎng)基正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分及其適宜的使用量?？疾斓囊蛩赜刑荚刺砑恿?、氮源添加量、復(fù)合氮源添加比例、無機鹽添加量。借助正交設(shè)計助手軟件，根據(jù)表1、2，采用L9（34）正交表進行試驗，離心發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌3次，收集菌體，65℃烘干至恒重。

表1 各成分添加量

表2 各實驗組培養(yǎng)基配比

1.3.7 XS-1發(fā)酵培養(yǎng)基硒添加量的優(yōu)化

利用最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵，硒添加量為500、1 000、1 500、2 000mg/kg和2 500mg/kg。

1.4 總硒的測定

收集干燥后的菌體，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.93-2010測定總硒。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)收集干燥后的菌體重量的數(shù)據(jù)，應(yīng)用下列公式計算生物量：生物量（mg/kg）=（M1/M2）×1 000。其中：M1為干燥后的菌體重量，g；M2為發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的總質(zhì)量，kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 XS-1生長曲線的測定

利用肉湯培養(yǎng)基，接種XS-1菌種，每發(fā)酵2h取樣測定其OD值，測定其生長曲線如圖1所示。

圖1 XS-1生長曲線

由圖1曲線可見，0～12h為適應(yīng)期，12～20h為對數(shù)期，20～44h均為穩(wěn)定期，本實驗未測量XS-1的衰亡期。

2.2 XS-1種液的制備

根據(jù)圖1，種液發(fā)酵到12小時后，每兩個小時取樣測其吸光度，吸光度為1.0-1.8，則種液符合要求。

2.3 XS-1培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

改變不同的培養(yǎng)基，接種XS-1菌種，測定其生物量和總硒量如圖2所示。

圖2 不同碳源對XS-1的影響

由圖2可知，碳源為葡萄糖或蔗糖時，生物量及總硒量均顯著高于其他碳源組，葡萄糖實驗組與蔗糖實驗組相比，差異不明顯。蔗糖實驗組生物量及總硒量略高于葡萄糖實驗組，因此，蔗糖為最優(yōu)碳源。

不同蔗糖添加量對XS-1的生物量影響實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同蔗糖添加量對XS-1的影響

由圖3可看出，不同蔗糖添加量對XS-1的生物量影響不顯著，蔗糖添加量為8%或10%時，總硒量顯著高于其他實驗組。蔗糖添加量為8%的實驗組與蔗糖添加量為10%的實驗組相比，差異不顯著。蔗糖添加量為8%的實驗組的生物量及總硒量略高于蔗糖添加量為10%的實驗組，因此，蔗糖的最適添加量為8%。

2.4 XS-1培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

培養(yǎng)基不同氮源的優(yōu)化實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同氮源對XS-1的影響

由圖4可得，氮源為牛肉膏與酵母膏（1%∶1%）或蛋白胨與酵母膏（1%∶1%）時，生物量略高于其他氮源組，氮源為牛肉膏與酵母膏（1%∶1%）或蛋白胨與牛肉膏（1%∶1%）時，總硒量顯著高于其他氮源組。因此，綜合考慮，牛肉膏與酵母膏為最優(yōu)氮源。

不同牛肉膏與酵母膏（1∶1）添加總量對XS-1的影響實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同牛肉膏與酵母膏（1∶1）添加總量對XS-1的影響

由圖5可得，牛肉膏與酵母膏（1∶1）添加量為4%的實驗組，總硒量顯著高于其他實驗組，生物量略高于其他實驗組，因此，牛肉膏與酵母膏（1∶1）的最適添加總量為4%。

實驗不同牛肉膏與酵母膏添加比例對XS-1的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，牛肉膏與酵母膏的添加比例為2∶1、3∶2、2∶3時，生物量顯著高于其他實驗組，牛肉膏與酵母膏的添加比例為2∶3時，總硒量顯著高于其他實驗組。因此，綜合考慮，牛肉膏與酵母膏的最優(yōu)添加比例為2∶3。

2.5 XS-1培養(yǎng)基無機鹽的優(yōu)化

XS-1培養(yǎng)基無機鹽的優(yōu)化實驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同無機鹽對XS-1的影響

由圖7可得，3種無機鹽實驗組，生物量差異不顯著，無機鹽為MgSO4?7H2O時，總硒量顯著高于其他兩種無機鹽實驗組，因此，MgSO4?7H2O為最優(yōu)無機鹽。

實驗不同MgSO4·7H2O添加量對XS-1的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同MgSO4·7H2O添加量對XS-1的影響

由圖8可知，MgSO4?7H2O添加量為0.45%的實驗組與其他實驗組相比，生物量顯著低于其他實驗組，其他實驗組的生物量差異不顯著，MgSO4?7H2O添加量為0.15%的實驗組，其生物量及總硒量略高于其他實驗組。因此，MgSO4?7H2O的最適添加量為0.15%。

2.6 XS-1培養(yǎng)基正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行正交設(shè)計優(yōu)化實驗，采用L9（34）正交設(shè)計，按表1、2，實驗優(yōu)化，結(jié)果如圖9所示。

圖9 XS-1的培養(yǎng)基成分正交試驗的結(jié)果

由圖9可知，第5組的生物量于總硒量顯著高于其他組。因此，XS-1的優(yōu)化培養(yǎng)基配比為：蔗糖的總添加量為10%，牛肉膏與酵母膏的添加比例為2∶3，牛肉膏與酵母膏的總添加量為4%，MgSO4?7H2O的總添加量為0.05%。

3 結(jié)論

本實驗針對本實驗室已有天然超富硒酵母XS-1，研究其生長曲線，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，即不同碳源、氮源、無機鹽以及促生長因子對該酵母富硒發(fā)酵的影響，以期能得到有較高硒含量以及得率較高的XS-1的培養(yǎng)基配方，即最大限度地利用現(xiàn)有的這種天然聚硒酵母。

通過單因素試驗得知，蔗糖為最優(yōu)碳源，牛肉膏與酵母膏為最優(yōu)氮源，MgSO4·7H2O為最優(yōu)無機鹽。同時，蔗糖的最適添加量為8%，牛肉膏與酵母膏（1∶1）的最適添加總量為4%，牛肉膏與酵母膏的最優(yōu)添加比例為2∶3，MgSO4·7H2O的最適添加量為0.15%。但這并不代表這些條件的疊加就是最優(yōu)的培養(yǎng)基配方，因此，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，需要再利用正交實驗來確定最終的最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

綜上所述，本實驗最終得到XS-1的最佳培養(yǎng)基配比為：蔗糖的總添加量為10%，牛肉膏與酵母膏的添加比例為2∶3，牛肉膏與酵母膏的總添加量為4%，MgSO4·7H2O的總添加量為0.05%。

[1]王端好,周河治.亟需開發(fā)利用的有機硒產(chǎn)品[J].輕工科技,2013,30(1):6-7.

[2]Chen J.An original discovery: selenium deficiency and Keshan disease (an endemic heart disease)[J].Asia Pac J Clin Nutr,2012,21(3):320-326.

[3]Weeks BS,Hanna MS,Cooperstein D.Dietary selenium and selenoprotein function[J].Med Sci Monit,2012,18(8):127-132.

[4]鄒楠,王學(xué)東,閻兵,等.不同后處理富硒酵母對小鼠抗氧化力、免疫力及硒沉積的影響[J].中國飼料,2016,27(8):40-42.

[5]Rotruck JT,Pope AL,Ganther HE,et al.Selenium:Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J].Sxience,1973,179(4073):588-590.

[6]Smith JL,Goos S.Selenium nutriture in total parenteral nutrition patients: Intake levels[J].Jpen Journal of Parenteral &Enteral Nutrition,1980,4(1):23-26.

[7]李改平,劉子川,王夢亮.有機硒和無機硒對小鼠抗氧作用比較研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,2(3):19-21.

[8]Alim Ohamady R,Aliarabi H,Bahari A,et al.Influence of different amounts and sources of selenium supplementation on performance,some blood parameters，and nutrient digestibility in lambs [J].Biol Trace Elem Res,2013,154(1):45-54.

[9]王宏祥,王昕,張建斌,等.不同硒源對蛋雞組織硒含量、GPX活性和肝臟GPX-4 mRNA 表達(dá)的影響[J].中國飼料,2013,24(11):26-28.

[10]丁文靖,劉力,祝曉蕾.硒酵母的研制及分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1992,23(5):73-74.

[11]吳競,王陽光,劉永杰,等.不同酵母菌種富硒能力比較與發(fā)酵條件優(yōu)化[J].畜牧與獸醫(yī),2012,44(1):15-18.

[12]郭金玲,劉莉君.酵母突變株最優(yōu)富硒發(fā)酵條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(2):490-492．

[13]張國蓉,王燕,劉安軍.硒酸精氨酸培養(yǎng)富硒酵母的條件優(yōu)化[J],現(xiàn)代食品科技,2008,24(10):1006-1011.

[14]陳里,詹逸舒,吳永堯．富硒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,35(3):237-241.

[15]王端好.富硒酵母的選育及其培養(yǎng)基組分優(yōu)化研究[J].廣東化工,2014,41(6):45-46.

Study on the Nutrient Component of the Selenium Yeast Chen Fei-fei1,2,Yao Wen-hua1,2*，Li Hong-ying1,2

(1.Agricultural Sciences Academy of Enshi in Hubei Province,Hubei Enshi 445000;2.Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.,Ltd.,Hubei Enshi 445000)

To obtain a culture medium with a higher selenium content and a higher yield of XS-1,the single-factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the culture medium of natural super selenium enriched yeast XS-1.The results showed that the optimum medium ratio of XS-1 was 10% sucrose,the proportion of extractum carnis and yeast extract was 2∶3,the total amount of extractum carnis and yeast extract was 4%,the amount of MgSO4·7H2O was 0.05%.The optimized medium is more favorable for the growth of yeast XS-1.

Yeast;Culture medium;Optimization;Selenium

TQ920.1

A

2096-0387（2017）03-0018-05

湖北省科技支撐計劃資助項目（2013BEC048）。

陳菲菲（1988-），女，湖北恩施人，碩士，工程師，研究方向：食品微生物。

姚文華（1968-），女，湖北天門人，本科，副高級農(nóng)藝師，研究方向：食品微生物。