唐軼君，張建軍，李晶，寧鑫思，蔣麗娜

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都610199）

水中銅綠假單胞菌盲樣考核結果與分析

唐軼君，張建軍，李晶，寧鑫思，蔣麗娜

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都610199）

為客觀反映包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測能力，保證檢測結果的準確性，本文依據國家標準GB/T 8538-2008和盲樣考核作業(yè)指導書，對某包裝飲用水樣品進行處理和銅綠假單胞菌檢驗，用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）和API 20NE對檢驗結果進行鑒定。結果表明：編號為5664、5663、5676、5679和5671的樣品未檢出銅綠假單胞菌，編號為5683、5669、5675、5696和5682的樣品檢出銅綠假單胞菌?？偟膩砜矗?0個樣品的檢測結果均為滿意。

包裝飲用水；銅綠假單胞菌；盲樣考核

銅綠假單胞菌俗稱綠膿桿菌，在自然界中分布廣泛，為淡水和土壤中最常見的細菌種類之一，空氣、動物皮膚、腸道、呼吸道等處均可有該菌的存在。銅綠假單胞菌可通過水源、土壤、工器具、接觸等多種途徑傳播，并對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素及不良環(huán)境有極強的抵抗力[1]。研究表明，銅綠假單胞菌可以產生多種外毒素、內毒素等致病因子，是導致人類急性腸道疾病和皮膚炎癥的完全致病菌。老弱病幼孕等抵抗力較差的人群，飲用或使用銅綠假單胞菌污染的包裝飲用水存在健康風險[2]。現階段，我國國家標準GB 19298-2014《食品安全國家標準包裝飲用水》、GB 8537-2008《飲用天然礦泉水》中，均明確規(guī)定每250mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出[3，4]。

為了解和證明四川省食品藥品檢驗檢測院實驗室對包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測水平和檢測能力，為實驗室對水中銅綠假單胞菌的檢測提供外部質量保證，增強客戶及相關委托方對實驗室出具可靠數據的信心，四川省食品藥品檢驗檢測院參加了由中國食品藥品檢定研究院組織的包裝飲用水中銅綠假單胞菌盲樣考核定性檢驗，并取得了滿意的成績。

1 材料與方法

1.1 待測樣品

包裝飲用水中銅綠假單胞菌盲樣考核定性檢測樣品，為10個裝有菌球的小西林瓶和10瓶瓶裝水。10個小西林瓶上的樣品編號和10瓶瓶裝水上的樣品編號為一一對應關系，分別為5679、5664、5676、5682、5683、5671、5663、5696、5669和5675，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

CN瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；革蘭氏染液，北京陸橋技術有限責任公司；氧化酶試紙，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；APⅠ 20NE，法國梅里埃公司；乙酰胺肉湯，北京陸橋技術有限責任公司；甲酸（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA），德國布魯克公司（Bruker Daltonics）；細菌實驗標準品（Bacterial Test Standard，BTS），德國布魯克公司（Bruker Daltonics）。

1.3 儀器及耗材

0.45 μm濾膜，浙江泰林生物技術股份公司；多聯過濾系統，德國SARTORⅠUS公司；恒溫培養(yǎng)箱，美國THERMO公司；暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠；光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；BⅡ生物安全柜，北京東聯哈爾公司；MALDⅠ-TOF-MS/MS（Autoflex Speed），BioTyper、FlexAnalysis分析軟件，德國布魯克公司。

1.4 檢測方法

按照包裝飲用水中銅綠假單胞菌定性檢驗樣品作業(yè)指導書的要求和GB/T 8538-2008《飲用天然礦泉水檢測方法》[5]對樣品進行檢測。并使用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDⅠ-TOFMS）進行快速篩查，用APⅠ 20NE對檢驗結果進行鑒定。同時以ATCC 27853銅綠假單胞菌作為陽性對照菌株，以ATCC 25922大腸埃希氏菌作為陰性對照菌株進行試驗。過濾水樣的同時增加一組已滅菌水樣作為空白對照。

實驗室接到樣品后立即進行檢測。在生物安全柜內將裝有水的瓶子打開，打開與水瓶上批號相同的西林瓶，將西林瓶內菌球倒入水瓶內，充分混勻后使用濾膜過濾。將過濾水樣后的濾膜以無菌操作移放在CN瓊脂培養(yǎng)基上。依此法分別對10件樣品進行處理。

將平板置于（36±1）℃培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)24h時觀察一次結果，在培養(yǎng)48h時再觀察一次結果。

1.5 結果觀察

觀察濾膜上是否有藍色或綠色的菌落、紅褐色菌落，如有其他顏色菌落，則放在365nm紫外光下觀察。挑取平板上的藍色或綠色菌落和產熒光的淡黃色菌落，接種營養(yǎng)瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)24h。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的單菌落，進行革蘭氏染色、氧化酶試驗，并接種乙酰胺肉湯試驗管，（36±1）℃培養(yǎng)24h，然后向每支乙酰胺肉湯試驗管中滴入一兩滴鈉氏試劑，檢查各管產氨情況。

1.6 基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）鑒定

用一次性接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上單菌落少許菌體，在MTP 384 Ground Steel靶板的靶點內涂布成一個薄層，在上述樣品點上覆蓋1μL 70%的甲酸溶液后在室溫下自然晾干（約10min），再在其上覆蓋1μL的HCCA溶液，并在室溫下自然晾干（約10min）。

儀器參數如下：Smartbeam-Ⅱ激光器，線性正離子（LP）采集模式，加速電壓為19.50kV，延遲提取電壓為18.15kV，聚焦電壓為7.00kV，質量范圍為2 000～20 000Da，激光頻率為500Hz。每次試驗前用標準品溶液BTS進行質譜儀的質量校正。將靶板送入MALDⅠ-TOF-MS/MS進樣倉，用FlexControl進行質譜采集，并用BioTyper、FlexAnalysis分析軟件進行比對鑒定分析。

1.7 API 20NE鑒定

用一次性接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上單菌落少許菌體，依照APⅠ 20NE的說明書，對其進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 結果觀察和初步鑒定

觀察CN平板上的濾膜，結果如表1所示。樣品5679、5664、5676、5671和5663在CN平板上為黃色菌落，在365nm紫外光下觀察為有熒光菌落，鏡檢觀察為革蘭氏陰性，無芽胞桿菌，乙酰胺肉湯結果為陰性，氧化酶試驗為陽性。樣品5682、5383、5693、5669和5675為綠色菌落，鏡檢觀察為革蘭氏陰性，無芽胞桿菌，乙酰胺肉湯結果為陽性，氧化酶試驗為陽性。同時進行檢驗的陽性對照平板ATCC 27853銅綠假單胞菌，在CN平板上菌落形態(tài)為綠色菌落，鏡檢為革蘭氏陰性，無芽胞桿菌，乙酰胺肉湯反應為陽性，氧化酶試驗陽性。陰性對照平板ATCC 25922大腸埃希氏局，在CN平板上未生長。檢查ATCC 25922大腸埃希氏菌的工作菌株，鏡檢結果為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，乙酰胺肉湯結果為陰性，氧化酶試驗為陰性?？瞻讓φ盏钠桨迳辖Y果也為未生長。

表1 CN平板上的菌落形態(tài)和初步鑒定結果

2.2 基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）鑒定結果

用儀器配套軟件BioTyper將獲得的質量圖譜與標準菌株圖譜庫進行比對鑒定，比對分值及鑒定水平見表2。其中標準菌株ATCC 27853銅綠假單胞菌的鑒定結果為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），樣品5682、5383、5693、5669和5675鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），樣品5679、5664、5676、5671和5663鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）或是蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）。

2.3 API 20NE鑒定結果

參照APⅠ 20NE的使用說明書，對樣品進行鑒定，結果見表3。其中，標準菌株ATCC 27853銅綠假單胞菌的鑒定結果為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），樣品5679、5664、5676、5671和5663鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），樣品5682、5383、5693、5669和5675鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

3 討論

積極參加盲樣考核和能力驗證活動，是對實驗室技術能力和管理狀況進行考核的方法之一，是保障實驗室資質認定工作質量有效性的重要手段，對實驗室質量控制有著非常重要的意義。從2015年GB 19298-2014《食品安全國家標準包裝飲用水》[3]開始實施以來，四川省食品藥品檢驗檢測院實驗室連續(xù)2a對四川省內的包裝應用水進行抽樣檢驗，發(fā)現銅綠假單胞菌的檢出率較高。為了解四川省食品藥品檢驗檢測院實驗室對銅綠假單胞菌檢驗能力的真實水平，增加客戶及相關方對實驗室出具數據的信心，證明實驗室對銅綠假單胞菌的檢驗能力，參加了此次由中國食品藥品檢定研究院組織的包裝飲用水中銅綠假單胞菌盲樣考核定性檢驗活動，盲樣考核結果為滿意。

本次試驗除了使用了GB/T 8538-2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》[5]對銅綠假單胞菌進行檢驗外，依據此次盲樣考核發(fā)放的作業(yè)指導書，對樣品中檢出的可以菌落都使用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDⅠ-TOF-MS）和APⅠ 20NE試紙條進行了生化鑒定。

MALDⅠ-TOF-MS是通過采集微生物菌體經軟電離后產生的蛋白質、多肽等組分的加氫離子質譜圖，利用圖譜分析軟件與數據庫中的標準菌株質譜圖進行比對以獲得鑒定結果的生物質譜技術，具有檢測速度快、通量高、耗材成本低、靈敏度和準確度高等優(yōu)勢。崔學文等[6]曾指出對銅綠假單胞菌良好的鑒定效果。但本文中使用的陰性對照菌株奇異變形桿菌、布氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌均為氧化酶陰性的桿菌。從本次試驗結果可以看出，MALDⅠ-TOF-MS可以很好地鑒定出銅綠假單胞菌，但對惡臭假單胞菌這類氧化酶陽性，且與銅綠假單胞菌同源性較高的菌株，則很難分辨出其種類。相比之下，APⅠ 20NE能很確定地給出惡臭假單胞菌的結果。說明APⅠ 20NE對氧化酶陽性的革蘭氏陰性桿菌的鑒定能力較為可靠，MALDⅠ-TOF-MS檢驗過程簡單，速度快，可以很好地分辨出銅綠假單胞菌與非銅綠假單胞菌，對大批量桶裝飲用水進行檢測時，可以使用MALDⅠ-TOF-MS進行初篩，若要獲得更準確的試驗結果，非目標菌進行確認，則需要APⅠ 20NE的輔助。

表2 MALDI-TOF-MS鑒定結果

表3 API 20NE鑒定結果

4 結論

本文依據國家標準GB/T 8538-2008和盲樣考核作業(yè)指導書，用MALDⅠ-TOF-MS和APⅠ 20NE對包裝飲用水中銅綠假單胞菌進行鑒定，結果表明檢測結果均為滿意。

[1]馬群飛.瓶裝飲用水銅綠假單胞菌污染研究進展[J].微生物學免疫學進展,2003,31(2):95-98.

[2]陳松,李紅,李德華,等.桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染情況分析[J].現代預防醫(yī)學,2015,42(6):1129-1130,1135.

[3]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB 19298-2014食品安全國家標準包裝飲用水[S].北京:中國標準出版社,2014.

[4]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB 8537-2008飲用天然礦泉水[S].北京:中國標準出版社,2008.

[5]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 8538-2008飲用天然礦泉水檢驗方法[S].北京:中國標準出版社,2008.

[6]崔學文,羅慧萍,李增婷,等.基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜在銅綠假單胞菌鑒定中的應用[J].現代預防醫(yī)學,2016,43(10):1862-1867.

Results and Analysis of Pseudomonas aeruginosa Blind Samples in Water

Tang Yi-jun,Zhang Jian-jun,Li Jing,Ning Xin-si,Jiang Li-na
(Sichuan Institute of Food and Drug Control,Sichuan Chengdu 610199)

In order to objectively reflect the detection capability of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water,and ensure the accuracy of the results of laboratory tests,the laboratory of Sichuan Institute of Food and Drug Control participated in the Pseudomonas aeruginosa blind samples test in water organized by National Institutes for Food and Drug Control.The samples were handled and inspected by GB/T 8538-2008 and the blind samples instructions,identified and analyzed by MALDI-TOF-MS and API 20NE.The results showed that Pseudomonas aeruginosa were not detected in Code 5664,5663,5676,5679 and 5671,Pseudomonas aeruginosa were detected in Code 5683,5669,5675,5696 and 5682.Overall,the results of the ten samples were satisfactory.

Packaged drinking water;Pseudomonas aeruginosa;Blind samples test

R155

A

2096-0387（2017）03-0046-04

唐軼君（1984-），女，碩士，工程師，研究方向：食品微生物檢驗。