閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

顯微介導(dǎo)河蟹總DNA導(dǎo)入鏡鯉的檢測(cè)與分析

閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將河蟹總DNA直接導(dǎo)入鏡鯉受精卵內(nèi)，再利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的外源DNA。在30對(duì)AFLP引物中，有3對(duì)引物擴(kuò)增出供體基因片段，即在顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉中均有和河蟹基因相同而對(duì)照鏡鯉沒有的條帶。對(duì)6尾陽(yáng)性顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明：陽(yáng)性顯微介導(dǎo)河蟹基因在鏡鯉中均含有供體基因目的片段。本研究在分子和基因水平上驗(yàn)證了河蟹總DNA可通過(guò)顯微介導(dǎo)方式整合到鏡鯉基因組中，為顯微介導(dǎo)外源總DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用提供新的思路。

顯微介導(dǎo)；河蟹；總DNA；鏡鯉

遠(yuǎn)緣雜交（distanthybridization）是親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種間、屬間的生物個(gè)體間雜交，可促進(jìn)種屬間的基因交流，創(chuàng)造新物種[1]，是魚類育種基本手段之一[2,3]。而顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)就是利用外源總DNA導(dǎo)入技術(shù)，將超遠(yuǎn)緣異源供體總DNA導(dǎo)入受體基因組來(lái)改善鯉科魚類的品質(zhì)。顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交與轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的基因工程不同，而機(jī)理與自然的漸滲雜交有相同之處，都是實(shí)現(xiàn)外源DNA分子片段的雜交，其供體染色體和受體染色體很少發(fā)生配對(duì)現(xiàn)象[4-6]。利用供體基因資源進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交可以引入大量具有供體性狀的功能基因，特別是一些新基因有可能重組進(jìn)入受體，而進(jìn)入受體的供體遺傳物質(zhì)可以調(diào)控基因表達(dá)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等[7,8]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將供體基因組DNA導(dǎo)入受體基因組中而實(shí)現(xiàn)外源基因片段的雜交，克服種屬間遠(yuǎn)緣雜交的不親和性、雜種不育，而外源基因的高水平表達(dá)可以克服品質(zhì)性狀的低遺傳力特征，使供體的優(yōu)良性狀在受體魚中得以體現(xiàn)，可以有計(jì)劃有目的的選擇供體總DNA片段[9]。利用顯微介導(dǎo)總DNA導(dǎo)入技術(shù)產(chǎn)生有供體片段存在的大量原代和子代個(gè)體，再結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，可加快魚類品種改良和新種產(chǎn)生的過(guò)程。

德國(guó)鏡鯉CyprinuscarpioL.鱗片少，核型與鯉核型基本一致，從原西德引進(jìn)后，經(jīng)多年的系統(tǒng)選育，已成為我國(guó)主要的鯉養(yǎng)殖品種之一。德國(guó)鏡鯉由于生長(zhǎng)速度超過(guò)其他鯉，已被全國(guó)水產(chǎn)良種審定委員會(huì)審定為適合在我國(guó)推廣的水產(chǎn)優(yōu)良養(yǎng)殖品種[10,11]。河蟹（中華絨螯蟹）Eriocheir sinensis肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素和維生素A，是優(yōu)良的遺傳資源[12,13]。如果將這些有益的營(yíng)養(yǎng)特性導(dǎo)入鏡鯉，創(chuàng)造出新的鏡鯉品種，對(duì)獲得一個(gè)肉質(zhì)優(yōu)良鏡鯉養(yǎng)殖新品種很有幫助。

本研究通過(guò)對(duì)顯微介導(dǎo)河蟹基因的鏡鯉進(jìn)行AFLP分析，在分子水平和基因水平上證明顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉已整合了河蟹DNA，從而證明本方法的實(shí)際應(yīng)用效果，為淡水養(yǎng)殖魚類的改良提供一種全新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

河蟹購(gòu)于哈爾濱市水產(chǎn)市場(chǎng)，鏡鯉取自黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗(yàn)站。顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉由黑龍江水產(chǎn)研究所遺傳育種與生物技術(shù)研究室制備。

1.1.2 引物與試劑

在上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司購(gòu)買Taq酶和T4-DNA連接酶；在大連寶生物公司購(gòu)買DNA Marker（DL2000）；接頭及引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供合成。AFLP接頭和通用引物序列及選擇性引物序列見表1。

表1 AFLP接頭及引物序列Tab.1 Adapter and primer sequences of AFLP

1.1.3 河蟹總DNA的制備

河蟹基因組DNA的提取依毛瑞鑫等的方法[12]稍加改動(dòng)。取約100mg河蟹肌肉經(jīng)液氮磨碎，放入1.5mL離心管中；在管中加入 500μL緩沖液（100mmol/LNaCl；10mmol/LTris-Cl，pH8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0）混勻，再加入終質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的SDS和100μg/mL的蛋白酶K；在55℃水浴鍋內(nèi)消化至液體透明；待冷卻后加入等體積的飽和酚（pH8.0）抽提1次，用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1次；離心后提取上清液，加入2倍體積的冷凍無(wú)水乙醇沉淀DNA，收集絮狀沉淀；70%的乙醇洗滌沉淀 2次，7 500r/min離心5min，自然干燥后加入TE溶解。取出其中的l管DNA，用超聲波（TH-800B型數(shù)控超聲波儀）打斷大片段DNA，將樣品DNA稀釋至終濃度200ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試驗(yàn)魚基因組DNA提取

顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉DNA的提取方法參見閆學(xué)春等[14]。在加有裂解液的試管中加入100mg鰭條，55℃消化，中間不時(shí)輕輕搖動(dòng)，待組織完全消化后取出，加入酚-氯仿混合液抽提2次；加入RNA酶，37℃保溫30min，再用等體積氯仿抽提1次，然后透析16h，直至透析液OD270＜0.05，加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌1次，自然干燥，加入0.1×TE溶解，置4℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 外源基因?qū)?/p>

參見閆學(xué)春等[15]。每年5～6月繁殖季節(jié)，選擇性成熟的鏡鯉親魚，注射鯽腦垂體和促黃體釋放激素類似物的混和合物進(jìn)行人工催產(chǎn)，采集一定數(shù)量的高質(zhì)量鏡鯉卵子和4℃冰箱中保存的精液，進(jìn)行干法授精，受精卵分散粘附在培養(yǎng)皿上，以國(guó)產(chǎn)可三維移動(dòng)的顯微操作儀，用自制的玻璃注射針給1～2細(xì)胞期的鏡鯉受精卵顯微注射。每個(gè)受精卵注射量為1nL。對(duì)照受精卵僅注射生理鹽水。注射后的鯉受精卵于22～23℃水族箱孵化，同時(shí)用氣泵充氣直至出膜。共導(dǎo)入鏡鯉受精卵1 600粒，獲得試驗(yàn)魚288尾，放入池塘強(qiáng)化培育。

1.2.2 AFLP試驗(yàn)

AFLP試驗(yàn)采用閆學(xué)春等[15]的方法。

1.2.2.1 酶切反應(yīng)

在37℃水浴中，利用Mse I/Eco R I對(duì)DNA樣品雙酶切（3～6h），電泳檢測(cè)酶切效果（1%的瓊脂糖凝膠），再將DNA樣品放于65℃水浴20min（使酶失活），4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 連接反應(yīng)

連接反應(yīng)體系包括T4-DNA連接酶2μL，酶切DNA樣品 4μL，MseⅠ接頭 1.0μL，Eco RⅠ接頭1.0μL，PEG 2μL，Buffer2μL，加無(wú)菌水至反應(yīng)總體積20μL。16℃連接過(guò)夜。

1.2.2.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)條件為：72℃2min，94℃30s，56℃30s，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，72℃溫育10min。反應(yīng)混合液體系為：Buffer 18μL，MseⅠ引物（M-C 10mmol/L）1μL，Eco RⅠ引物（E-A 10mmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.3μL，無(wú)菌水2.7μL。在23μL反應(yīng)混合液中加入連接產(chǎn)物2μL。PCR擴(kuò)增后用無(wú)菌水稀釋40倍，-20℃保存。

1.2.2.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)混合液為：Buffer 18μL，MseⅠ引物（10mmol/L）1μL，Eco RⅠ引物（10mmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.3μL，2μL稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)菌水2.7μL，反應(yīng)體積為25μL。PCR反應(yīng)條件：先94℃ 2min，再94℃30s，65℃30s（每循環(huán)退火溫度降低0.7℃），72℃90s，13個(gè)循環(huán)后變?yōu)椋?4℃30s，56℃30s，72℃90s，23個(gè)循環(huán)。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

參見閆學(xué)春等[15]的方法。緩沖液為：98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青。6%的變性聚丙烯酰胺配制為：丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺19∶1，7mol/L尿素，1×TBE。利用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的上樣緩沖液，經(jīng)95℃變性10min后，立即冰浴，每個(gè)樣品上樣量為5μL，上樣前（凝膠55W恒功率條件下）預(yù)電泳30min至溫度達(dá)到55℃。電泳結(jié)束后銀染、照相、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉基因組DNA提取

提取的顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉基因組DNA的OD260/OD280為1.8～2.0（紫外分光光度計(jì)和EB染色的熒光強(qiáng)度雙重測(cè)定），所測(cè)個(gè)體DNA含量為3～4μg/μL。瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：DNA條帶清晰無(wú)彌散現(xiàn)象，表明提取的顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉基因組DNA純度高，蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)含量少，可以用于AFLP后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

圖1 顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.1 Agarose electrophoresis of the genom ic DNA in m irror carpm icro-injected w ith Chinese m itten handed crab genom ic DNA

2.2 顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉AFLP擴(kuò)增

以河蟹基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以普通鏡鯉基因組DNA為陰性對(duì)照，檢測(cè)59尾顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉基因組。在30對(duì)AFLP引物中，有3對(duì)引物對(duì)25尾顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉擴(kuò)增出供體基因片段，即和河蟹基因相同的帶，而對(duì)照鏡鯉沒有，陽(yáng)性率為42.37%。圖2是引物E-ACC，M-CTT擴(kuò)增顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的結(jié)果，箭頭所指是擴(kuò)增的供體基因組片段。

圖2 顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的AFLP電泳圖Fig.2 AFLP electrophoresis of the genom ic DNA in m irror carp m icro-injected w ith Chinesem itten handed crab genom ic DNA

2.3 顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉產(chǎn)物凝膠測(cè)序

在AFLP試驗(yàn)結(jié)果中，顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉與河蟹有相同的條帶，而在對(duì)照鏡鯉中沒有的目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物濃度均為20ng/μL。對(duì)其中6尾陽(yáng)性顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明：陽(yáng)性顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉中均含有供體基因目的片段（圖3）。

圖3 供體基因序列與顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignments of donor and the genom ic DNA in m irror carp m icro-injected w ith Chinesem itten handed crab genom ic DNA

3 討論

AFLP是由荷蘭科學(xué)家Pieter Vos等[16]于1995年發(fā)明的一種DNA分子標(biāo)記，基因組經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割、連接接頭，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)能提供大量的多態(tài)性片段。該方法信息含量大、效率高，無(wú)需Southern雜交，沒有放射源的風(fēng)險(xiǎn)，已廣泛應(yīng)用在魚類研究中。如Rubinstein等[17]研究AFLP分子標(biāo)記在斑馬魚Barchydaniorerio的野生型和突變體不同組織及發(fā)育時(shí)期的表達(dá)；Young等[18]利用476個(gè) AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建虹鱒Oncorhynchus mykiss遺傳連鎖圖譜，經(jīng)過(guò)遺傳連鎖分析分別得到主連鎖群和小連鎖群32個(gè)和11個(gè)；王志勇等[19]用5對(duì)AFLP引物對(duì)大黃魚Larimichthyscrocea野生種群和養(yǎng)殖群體進(jìn)行分析，野生種群和養(yǎng)殖種群在多態(tài)性比例和個(gè)體遺傳差異存在顯著差異，野生種群顯著高于養(yǎng)殖群體；David等[20]利用AFLP技術(shù)對(duì)兩個(gè)鯉CyprinuscarpioL.種群進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)AFLP的多態(tài)性在草魚Ctenopharyngodonidella和鯉中為6.7%，而在觀賞鯉中為59.9%。說(shuō)明草魚和鯉與被檢測(cè)的其他魚有相當(dāng)遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；劉必謙等[21]利用AFLP技術(shù)把岱衢族大黃魚分為岱衢族大黃魚Ⅰ型和Ⅱ型；季士治等[22]為開展大鱗鲆分子研究，建立AFLP分子體系。利用AFLP技術(shù)在外源基因的檢測(cè)方面也得到應(yīng)用。佟廣香等[23]利用AFLP技術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)基因鯉的生態(tài)安全性，檢測(cè)不同比例轉(zhuǎn)基因鯉親本子一代基因組的分子遺傳學(xué)特征，結(jié)果表明逃逸轉(zhuǎn)基因鯉數(shù)量與生態(tài)安全直接相關(guān)；閆學(xué)春等[15]利用AFLP技術(shù)對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis基因鯉進(jìn)行外源DNA檢測(cè)，證明受體鯉中含有供體基因片段。本研究所獲得的AFLP指紋圖譜表明：顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉中存在河蟹特異性AFLP指紋，表明河蟹的供體基因成功滲入到受體鏡鯉基因組中。為進(jìn)一步找到精確的遺傳證據(jù)，本研究將與河蟹相同的AFLP條帶進(jìn)行回收、測(cè)序。結(jié)果表明：顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉片段序列與供體片段序列完全一致，進(jìn)一步證明河蟹基因在受體鏡鯉中存在的可靠性。

依靠顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，導(dǎo)入的外源基因和其他轉(zhuǎn)基因魚的的操作方法是一樣的，都采用顯微注射方法，其優(yōu)勢(shì)在于所導(dǎo)入的外源基因是未經(jīng)遺傳修飾的基因組DNA。用這種方法得到的魚與遠(yuǎn)緣雜交相近，只不過(guò)是基因組水平的遠(yuǎn)緣雜交。該技術(shù)方法簡(jiǎn)便，不受受體水產(chǎn)動(dòng)物種類限制，可任意選擇當(dāng)家優(yōu)良品種進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入，為遠(yuǎn)緣雜交不親和的水產(chǎn)動(dòng)物之間的基因重組創(chuàng)造了條件。而周光宇等[4]針對(duì)遠(yuǎn)緣雜交提出假說(shuō)，即“DNA片段雜交假說(shuō)”。該假說(shuō)提出，遠(yuǎn)緣雜交通過(guò)與母本DNA部分同源的DNA片段重組進(jìn)入母本，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)雜交，使母本性狀出現(xiàn)變異。供體總DNA在顯微介導(dǎo)的輔助下導(dǎo)入母本，并且包含全部供體遺傳信息，因此存在發(fā)生遠(yuǎn)緣雜交概率。在對(duì)與魚類品質(zhì)相關(guān)基因知之甚少的情況下，通過(guò)顯微介導(dǎo)外源總DNA的轉(zhuǎn)化，將一些有益營(yíng)養(yǎng)特性基因?qū)膈帲偻ㄟ^(guò)對(duì)后代的篩選，就可以獲得擁有高品質(zhì)的新性狀個(gè)體。

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Detection and Analysis of Mirror Carp Micro-injected with Total DNA in Chinese Mitten Handed Crab

YAN Xue-chun,LUAN Pei-xian,HE Li-chuan
（National Local JointEngineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding,Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding,Heilongjiang River FisheriesResearch Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In thisstudy,totalDNA of Chinesemitten handed crab（Eriocheirsinensis）was injected intomirror carp（Cyprinuscarpio）bymicro-injected distanthybridization technique,and the exogenous DNA inmirror carpmicro-injected Chinesemitten handed crab wasdetected by AFLPmolecularmarker technology.In the30 pairsof AFLPprimers,3 pairsof primershave amplified thegene fragmentsof donor,indicating that there is themicro-injected Chinesemitten crab gen found in only crab.The results showed that,cloned and sequenced amplification products revealed that there were transgene fragments in all the positive three scales of 6 positivemicro-injectedmirror carp.The findings verified that the totalDNA of crab was injected into three scales genome atmolecular and gene levels,providing a new strategy for theapplication ofm icro-injected exogenous totalDNA.

m icro-injected;Chinesem itten handed crab;totalDNA;m irror carp

Q959；S917

A

1005-3832（2017）03-0019-05

2017-02-06

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（HSY201707M）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目(2011AA100404)；國(guó)家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)項(xiàng)目.

閆學(xué)春(1964-)，男，研究員，從事分子生物學(xué)與基因工程育種研究.E-mail:yanxc8@163.com