鐵皮石斛不同外植體組培快繁技術(shù)比較

饒寶蓉 陳泳和 江文清 劉忠輝 梁彥 陳琦輝

摘要 [目的]篩選適宜鐵皮石斛繁殖的最佳方法。[方法]以鐵皮石斛成熟蒴果和1年生植株莖段作為外植體，研究 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度激素對鐵皮石斛種子和莖段誘導(dǎo)、增殖以及生根的影響，同時比較了傳統(tǒng)玻璃蘭花瓶與聚丙烯透明薄膜袋在鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)上的成本投入。[結(jié)果]適合鐵皮石斛誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；適合增殖的培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；適合生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠。對于工廠化生產(chǎn)而言，選用蒴果作為外植體具有利于無菌體系建立、增殖倍數(shù)多和苗長勢整齊一致等優(yōu)點，聚丙烯透明薄膜袋可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的玻璃蘭花瓶。[結(jié)論]該研究可為減少鐵皮石斛組培苗的生產(chǎn)成本、縮短生長周期、獲得大量優(yōu)質(zhì)組培苗提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛； 組織培養(yǎng)； 激素；種子；莖段；聚丙烯透明薄膜袋

中圖分類號 S503.53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0138-04

Comparison of Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of Different Explants in Dendrobium officinale

RAO Bao-rong1，2， CHEN Yong-he1，2*， JIANG Wen-qing2 et al

（1.Nanping Huake Biotechnology Co.， Ltd.， Jianyang，F(xiàn)ujian 354200；2.Nanping Institute of Agricultural Sciences，Jianyang，F(xiàn)ujian 354200）

Abstract [Objective]To select the best method for propagation of Dendrobium officinale.[Method]This experiment used mature capsule and annual stem segments of D.officinale as explants. The paper studied the effects of MS medium supplemented with different concentration hormones on induction， multiplication and rooting of seeds and stem segment. The paper also compared the cost of traditional vase and transparent polypropylene film bags on factory production. [Result]The appropriate medium for the induction of D. officinale was MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for the proliferation was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L banana+35 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan， the appropriate medium for rooting was 1/2MS+0.80 mg/LNAA+120 g/L banana+20 g/L sucrose+7.0 g/L carrageenan. The paper also showed that using capsule as explants was in favor of establishing the sterile system， multiplication times and consistent seedlings. Transparent polypropylene film bags can replace traditional vase.[Conclusion] The study provides certain theoretical basis for reducing production cost of D. officinale tissue culture seedling， shortening the growth period and getting a lot of high-quality tissue culture seedling.

Key words Dendrobium officinale；Tissue culture；Hormones；Seeds；Stem segments；Transparent polypropylene film bags

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又稱黑節(jié)草，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，含有多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物等大量有益于人體健康的藥用活性成分，具有抗腫瘤、抗凝血、降血脂、降血壓、提高免疫力、抗衰老等功效[1-2]，是一種名貴珍稀中藥材，在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》 中均被列為上品，被譽(yù)為“中華九大仙草之首”，被錄入2015版《藥典》。其主要分布于我國的浙江、云南、廣東、廣西、福建、湖南等?。▍^(qū)）以及澳大利亞、東南亞等國家（地區(qū)）。

鐵皮石斛對生長條件要求十分苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，加上長期過度采挖，造成野生資源瀕臨滅絕，而利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效擴(kuò)大鐵皮石斛的種植規(guī)模[3]。雖然目前關(guān)于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)有相關(guān)報道，但是鐵皮石斛試管苗生長周期長、生長整齊度不一、組織培養(yǎng)所需的成本過高等問題是制約其產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸。筆者采取不同外植體，對不同階段的培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選，同時對不同接種容器的生產(chǎn)技術(shù)及其工藝進(jìn)行研究，探討組培快繁過程中不同因素對鐵皮石斛生長發(fā)育的影響，以期獲得適宜的組培快繁條件，為減少組培苗生產(chǎn)成本、縮短生長周期、獲得大量優(yōu)質(zhì)的組培苗提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2014 年在南平市華科生物科技有限公司進(jìn)行。試驗材料為鐵皮石斛成熟蒴果、1年生鐵皮石斛植株莖段、不透水耐高溫高壓的聚丙烯透明薄膜袋與普通螺口玻璃蘭花瓶。

1.2 方法

1.2.1 無菌系建立。取鐵皮石斛成熟蒴果，在流水下沖洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，繼續(xù)用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，放在無菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒8 min后，無菌水沖洗6次，濾紙吸干外表水分，放入無菌盤子上用刀片將其剝開，將種子播在無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。約10 d后，看到原來的黃色粉末狀種子未被感染且開始轉(zhuǎn)為綠色小原球莖，即以播種方式建立無菌系（圖1）。

從1年生鐵皮石斛植株上選擇生長健壯的莖段，摘去葉片和膜質(zhì)葉鞘，在流水下沖洗60 min，用洗衣粉液浸泡20 min，繼續(xù)用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，放在無菌瓶中用0.1%的HgCl2消毒10 min后，再用無菌水沖洗6次，濾紙吸干水分，放入無菌盤子上，剪去頭尾兩端0.2 mm后，再剪成約1.0 cm長、帶節(jié)的小段，插入備好的無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插4～6個節(jié)。約7 d后發(fā)現(xiàn)，莖節(jié)未被殺死，節(jié)上有凸起，培養(yǎng)基表面無感染，即以莖段為外植體的無菌系建立（圖2）。

1.2.2 培養(yǎng)基設(shè)計。

以MS為基本培養(yǎng)基，在鐵皮石斛莖段叢生芽的誘導(dǎo)增殖基本培養(yǎng)基研究中，張書萍等均認(rèn)為MS培養(yǎng)基優(yōu)于供試的其他培養(yǎng)基[4-5]。根據(jù)試驗?zāi)康?，如誘導(dǎo)（表1）、增殖（表2）、生根（表3）等添加不同濃度的 6-BA

（6-芐基腺嘌呤）[6]，NAA（萘乙酸）[7]和有機(jī)添加物，附加蔗糖35 g/L（生根培養(yǎng)基中為20 g/L）、卡拉膠 7.0 g/L，pH 5.8（用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH）。滅菌條件：121 ℃、131 kPa滅菌20 min。培養(yǎng)基制備好后，置于無菌操作室中，放置72 h，打開紫外燈對無菌操作室進(jìn)行滅菌。

1.2.3 容器成本比較。

在傳統(tǒng)玻璃蘭花瓶和不透水耐高溫高壓的聚丙烯透明薄膜袋內(nèi)裝入等比例生根培養(yǎng)基，增殖苗高約2 cm，單株接入2種容器的培養(yǎng)基中，瓶苗每瓶18株，袋苗每袋14株。重復(fù)3次，定期觀察記錄，90 d時進(jìn)行生長勢對比及成本比較，總成本=（容器成本+培養(yǎng)基成本+清洗容器成本）×（1+污染率）。

1.2.4 培養(yǎng)條件。

材料接種后，在1 800 lx 光照下培養(yǎng)，光照時間11 h/d，溫度（25±1） ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)及無菌系建立情況比較

從表4可以看出，試驗所設(shè)計使用的培養(yǎng)基都能將種子及莖段外植體誘導(dǎo)出芽，誘導(dǎo)率在80%以上，其中以添加1.0 mg/L 6-BA，120 g/L香蕉的組合為好。各培養(yǎng)基中種子誘導(dǎo)出無菌苗的時間為20～35 d，而莖段誘導(dǎo)出無菌苗的時間為8～15 d；種子誘導(dǎo)率為80%～92%，莖段誘導(dǎo)率為86%～94%。2種外植體的誘導(dǎo)發(fā)生途徑不同，種子外植體需經(jīng)過種子胚萌發(fā)—愈傷組織誘導(dǎo)—原球莖誘導(dǎo)—原球莖分化—發(fā)芽等過程，而莖段外植體自植入培養(yǎng)基中10 d后，其莖節(jié)部芽體就出現(xiàn)凸起，并產(chǎn)生叢生芽簇，生長較快，芽體粗壯，30 d后能生成健壯完整的芽體，不需要經(jīng)歷原球莖誘導(dǎo)階段[8]。單從少量成苗的生長周期及保持性狀方面來看，莖段外植體培養(yǎng)的時間短，莖段外植體優(yōu)于種子外植體。但是從無菌系建立效率而言，種子外植體明顯優(yōu)于莖段外植體，種子誘導(dǎo)感染率8%～13%，而莖段誘導(dǎo)感染率為48%～62%。從生長整齊度來看，也是種子外植體優(yōu)于莖段外植體。鐵皮石斛誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠較好。

2.2 不同外植體建立的繁育體系增殖培養(yǎng)情況比較

以莖段為外植體的繁育途徑相對簡單，即莖段—叢生芽—完整植株3個階段，成苗周期短，平均增殖系數(shù)小，僅1.2～3.7，短期代數(shù)就可以直接用于生根，但是苗生長不整齊，從節(jié)上或基部陸續(xù)冒出小芽，生長不一（圖3）。而種子前期誘導(dǎo)較慢，一旦進(jìn)入原球莖開始分化階段，發(fā)芽后增殖系數(shù)較大，為5.3～7.8，葉濃綠，苗木生長整齊（圖4），經(jīng)過幾代的轉(zhuǎn)接瓶內(nèi)苗數(shù)量減少，苗逐漸變壯。從工廠化生產(chǎn)上看，種子繁育可在一定時間內(nèi)獲得大量的成苗。在增殖培養(yǎng)基中添加適量的香蕉效果好，增殖系數(shù)高，無菌苗生長正常，不出現(xiàn)莖粗短、玻璃化、黃化及水漬狀等情況，莖節(jié)間長而粗壯。試驗結(jié)果表明，香蕉的添加量以120 g/L為宜。綜合各因素可知，種子繁育可為鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)提供更好的基礎(chǔ)。從表5可以看出，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠培養(yǎng)基中進(jìn)行鐵皮石斛增殖培養(yǎng)較為適宜。

2.3 生根培養(yǎng)情況比較

NAA濃度在一定程度上影響著組培苗的生根時間、根系數(shù)量和瓶苗生長情況等。從表6可以看出，根的生長勢隨著NAA濃度的增加而逐漸遞增，平均生根系數(shù)為1.25～4.12，生根率也逐漸遞增。該試驗結(jié)果表明，在1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)較為適宜。

2.4 接種容器的成本比較 由圖5、6和表7可知，鐵皮石斛在蘭花瓶內(nèi)與在聚丙烯透明薄膜袋內(nèi)的長勢沒有明顯差異，生長周期也沒有顯著性差異。雖然聚丙烯透明薄膜袋中鐵皮石斛苗的感染率高于傳統(tǒng)蘭花瓶，但是總成本只是傳統(tǒng)蘭花瓶中的1/2（表8）。主要體現(xiàn)在一次性聚丙烯透明薄膜袋的成本較玻璃瓶成本低，而且采用一次性聚丙烯透明薄膜袋可節(jié)省人工成本等。采用一次性聚丙烯透明薄膜袋

對后期的出苗也十分有利，蘭花瓶出苗需用鑷子將苗從窄口瓶取出，這對苗的根、莖、葉都有一定量的損傷，且容易污染，而一次性聚丙烯透明薄膜袋育苗時只要將袋口完全剪開就可以保持完好的植株，有效提高了后期移栽的成活率。

3 結(jié)論與討論

試驗初步建立了一套較完整的鐵皮石斛組培快繁體系。組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有很多種，用成熟的蒴果消毒后進(jìn)行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖分化發(fā)育成完整植株是其中一種，也可以選擇適宜的外植體（莖段、莖尖、幼芽、葉片等）誘導(dǎo)形成擬原球莖或者叢生芽來實現(xiàn)快速繁殖，可解決鐵皮石斛資源緊缺問題。組織培養(yǎng)主要受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素的共同影響，其中激素種類和濃度是至關(guān)重要的[9-10]。試驗分別用種子和莖段作為外植體，研究了不同基本培養(yǎng)基、激素配比、有機(jī)添加物對鐵皮石斛種子萌發(fā)、原球莖增殖、分化和生根壯苗的影響，并對莖段發(fā)芽、生根壯苗長勢和時間進(jìn)行了比較，篩選出適合各個培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方。在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中，生長調(diào)節(jié)劑對各階段的生長分化促進(jìn)作用明顯，該試驗與唐桂香等[11]的研究相似。從工廠化生產(chǎn)育苗角度來看，苗的整齊度以及一定時間內(nèi)生產(chǎn)大量的瓶苗，種子擴(kuò)繁優(yōu)于莖段，主要體現(xiàn)在起步階段的種子外植體感染率有效降低，種子的增殖倍數(shù)高于莖段。加上鐵皮石斛的種子數(shù)量極多，快速繁殖可利用這一優(yōu)勢，利用種子進(jìn)行非共生萌發(fā)，進(jìn)而不斷地分化和增殖，產(chǎn)生種苗，因此這一途徑是種苗工廠化生產(chǎn)的重要途徑[12]。種子萌發(fā)適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+120 g/L香蕉+35 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.80 mg/L NAA+120 g/L香蕉+20 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠。

鐵皮石斛在蘭花瓶內(nèi)與在聚丙烯透明薄膜袋內(nèi)的長勢、生長周期方面沒有明顯的差異[13]，但是薄膜袋質(zhì)地輕，體積小，不易破損，裝箱和搬運方便，便于運輸和推廣，可減少回收和清洗容器的工序，達(dá)到省工、省時、省錢的目的，同時也給鐵皮石斛種植者帶來極大的方便，洗苗時對苗的損傷極小。袋培苗在降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率上有顯著優(yōu)勢，完全可以取代瓶培苗，但在操作工序上有一定的要求，在灌裝與高壓時必須保證培養(yǎng)基不得粘在袋口；沒有封口的培養(yǎng)基要及時接種并密閉袋口。袋培苗后期培養(yǎng)與煉苗污染率降低，其主要原因是袋培苗在接種后即用封口機(jī)將袋口全部封死，避免了培養(yǎng)過程中的2次污染。 而瓶式培養(yǎng)采用螺旋塑料蓋，難免存有空隙或松動，真菌孢子等易隨空氣進(jìn)入瓶內(nèi)造成污染[14]。筆者認(rèn)為袋式培養(yǎng)在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中是切實可行的，可以廣泛推廣應(yīng)用。

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