胡興杰++王則君++殷敏++李迪++陳楠

摘要 研究了細(xì)胞培養(yǎng)基中的胎牛血清（FB）對DNA四面體（etrahedral DNA nanostructure，DNs）進(jìn)入eLa細(xì)胞的速度和內(nèi)吞途徑的影響。采用自組裝技術(shù)得到熒光標(biāo)記的DNs結(jié)構(gòu)，利用PLC技術(shù)分離得到純度>95%的DNs單體，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微成像等技術(shù)比較了在有無血清的情況下，細(xì)胞攝取量隨時間的變化以及FB對DNs攝取途徑的影響。實驗結(jié)果表明，DNs在培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液環(huán)境中可以穩(wěn)定存在12 h以上，培養(yǎng)基中的FB能夠提高eLa細(xì)胞對四面體的攝取量， 但并未改變DNs進(jìn)入eLa細(xì)胞的內(nèi)吞途徑。本研究揭示了環(huán)境中蛋白質(zhì)等生物分子對于DNA四面體結(jié)構(gòu)與細(xì)胞界面相互作用的影響，為基于DNA納米材料的細(xì)胞學(xué)納米載體的設(shè)計和優(yōu)化提供了新思路。

關(guān)鍵詞 DNA納米結(jié)構(gòu)； DNA四面體； 細(xì)胞攝??； 血清； 胞吞途徑

1引 言

自組裝 DNA納米結(jié)構(gòu)作為一種新的納米材料，已被用于生物傳感、納米光子學(xué)等多個領(lǐng)域＼[1＼]。核酸分子獨特的堿基互補配對的特性，賦予了DNA結(jié)構(gòu)優(yōu)異的可精確設(shè)計性和位點修飾的可尋址性，因此通過精確的設(shè)計和高效的制備方法，研究者已經(jīng)制備出各種不同尺寸、形狀和維度的 DNA 納米結(jié)構(gòu)＼[2～5＼]。此外，作為一種生物分子，DNA納米結(jié)構(gòu)自身具有良好的生物相容性和可降解能力，因而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景＼[6～12＼]。DNA四面體（etrahedral DNA nanostructure， DNs）是一類合成方法簡單、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的DNA三維納米材料，通過4條DNA單鏈間的堿基互補配對作用能夠直接形成金字塔型的納米結(jié)構(gòu)＼[13＼]。核酸（如單鏈、雙鏈DNA等）本身表現(xiàn)為負(fù)電性，會與細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電斥力，通常需要借助于帶正電荷的轉(zhuǎn)染試劑才可以進(jìn)入細(xì)胞。然而DNs與一般負(fù)電性核酸結(jié)構(gòu)不同，在沒有轉(zhuǎn)染試劑輔助的情況下，可以直接被哺乳動物細(xì)胞大量攝取，表現(xiàn)出良好的生物應(yīng)用前景。

本課題組前期圍繞DNs作了大量工作，通過單顆粒示蹤技術(shù)研究了哺乳動物細(xì)胞對DNs的內(nèi)吞行為及其在細(xì)胞內(nèi)的運輸規(guī)律。發(fā)現(xiàn)DNs通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機制快速進(jìn)入細(xì)胞，隨后借助微管依賴的途徑，在細(xì)胞內(nèi)被有序運輸?shù)郊?xì)胞溶酶體內(nèi)，整個過程中DNs基本保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，改變DNs進(jìn)入溶酶體的宿命是其成為有效的運輸載體的關(guān)鍵，因此采用核定位序列功能化的DNs來逃脫溶酶體進(jìn)而運輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)＼[14＼]。本課題組還研究了DNs的體內(nèi)分布代謝以及DNs負(fù)載負(fù)載CpG后的效應(yīng)等＼[15＼]。但到目前為止，關(guān)于DNs與細(xì)胞的研究均未考慮環(huán)境中胎牛血清（FB）的影響。FB含有各種血漿蛋白、多肽、生長因子等，可通過吸附等作用在納米材料表面形成蛋白冠（Protein corona），改變納米顆粒的表面性質(zhì)，影響細(xì)胞攝取行為＼[16，17＼]。表面帶負(fù)電荷的DNs在含有FB的環(huán)境中，也可能會受到FB中帶正電的蛋白影響，改變其細(xì)胞內(nèi)吞機制。

在本研究中，借助共聚焦成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)，比較了FB對細(xì)胞攝取DNs速度的影響。12 h內(nèi)，在含有FB的培養(yǎng)基中，DNs被eLa細(xì)胞攝取的速度大于不含F(xiàn)B的情況，表明 FB有助于增加DNs的攝取速度。隨后采用抑制劑的研究方法，研究了FB對DNs攝取途徑的影響。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)B并沒有改變DNs通過小窩蛋白依賴的胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的機制。本研究揭示了血清的存在主要通過增加內(nèi)吞的形式影響到DNs與細(xì)胞的相互作用，為DNs作為智能藥物載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2實驗部分

21儀器與試劑

UV3010紫外分光光度計（日本日立公司）； F900熒光分光光度計（英國愛丁堡儀器公司）； Applied Biosystems Veriti 96 well hermal Cycler PCR儀（美國賽默飛世爾公司）； PLC系統(tǒng)配Waters 1525泵，Waters 2998光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）； EC色譜柱（Yarra 3 μm EC4000：Analytical 300 mm × 78 mm，美國Phenomenex公司）； NanoPhotometer P330核酸蛋白質(zhì)微量定量儀（德國Implen公司）； Box ChemiXL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國yngene G公司）； Nano Z90粒度儀（英國馬爾文公司）； Bruker Multimode 8， Nanoscope Ⅲa原子力顯微鏡（德國布魯克公司）； NL10 AFM針尖（美國 Veeco 公司）； Lecia C P8激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）； BD FACArray Bioanalyzer流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

三羥甲基氨基甲烷和NaCl（色譜純，美國igmaAldrich公司）； 甲基β環(huán)糊精（Methylβcyclodextrin， MβCD， 美國igmaAldrich公司）； GelRed DNA染料（Biotium）； 其余試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司； Dio和BCA蛋白試劑（江蘇碧云天有限公司）； MEM培養(yǎng)基，F(xiàn)B，Penicillin，rypsin，treptomycin和Lglutamine（美國Life echnology公司）； eLa細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院）； 35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿（杭州生友生物技術(shù)公司）。MWCO 30 KDa 超濾管（美國Millipore公司）。實驗所用水為Milli Q超純水（18 MΩ cm，美國Millipore公司）。熒光標(biāo)記的寡核苷酸（美國Invitrogen公司）采用PLC純化。核酸序列見表1。

22DNs的組裝、純化和表征

DNs由化學(xué)計量嚴(yán)格等同的四條單鏈DNA通過一步退火法進(jìn)行組裝。四條DNA單鏈在M 緩沖液（10 mmol/L risCl， 5 mmol/L MgCl2， p 80）中等摩爾混勻， 置于PCR 儀中，按照預(yù)設(shè)程序（95℃加熱10 min， 迅速冷卻至4℃， 保持20 min）退火， 即完成組裝。合成的DNs終濃度為1 μmol/L。

PLC所用流動相為25 mmol/L risCl， 450 mmol/L NaCl，p 74，流速1 mL/min，檢測波長260 nm。收集產(chǎn)物，進(jìn)一步使用截留分子量為 30 KDa的超濾管進(jìn)行濃縮，同時將高鹽流動相置換為M緩沖液。純化后的DNs稀釋為1 μmol/L，4℃儲存。純化前后的DNs使用6% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），冰浴條件下進(jìn)行表征，電壓100 V，電泳時間2～3 h，電泳結(jié)束后使用GelRed染色30 min，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

使用粒度儀對純化后的DNs的水合半徑和Zeta電位進(jìn)行測量，并用原子力顯微鏡（AFM）對其形貌進(jìn)行表征。將預(yù)先形成好的 DNs（10 nmol/L）滴在新剝離的云母表面，并在室溫下孵育3 min，然后用蒸餾水沖洗，吹干。在氣相下采用輕敲模式，得到的AFM圖像用Nanocope軟件進(jìn)行處理。

23熒光標(biāo)記的DNs穩(wěn)定性表征

純化后的DNs（濃度1 μmol/L）分別與MEM培養(yǎng)基（含10% FB）和細(xì)胞裂解液（超聲離心的方法制備，BCA蛋白試劑盒測得蛋白濃度為057 mg/mL，）混合（1∶4， V/V），37℃孵育0、2、4、8和12 h。孵育結(jié)束后，樣品統(tǒng)一使用6% PAGE進(jìn)行表征，并使用ImageJ自帶Gels插件進(jìn)行定量分析。

終濃度為100 nmol/L DNsCy3分別在含有10% FB的MEM培養(yǎng)基（FB+）和不含F(xiàn)B的MEM培養(yǎng)基（FB-）中孵育0、12和24 h，測量兩組試驗樣品在對應(yīng)時間點的熒光強度，每個時間點平行測量3次，得到24 h內(nèi)DNs的熒光強度在不同環(huán)境中的變化。

24細(xì)胞培養(yǎng)

eLa細(xì)胞在含10% FB，100 units/mL青霉素，100 units/mL鏈霉素和2 mmol/L LGlutamine的MEM培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

25細(xì)胞攝取DNs

在直徑35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中鋪板5 × 104 eLa細(xì)胞用于共聚焦成像，在24孔板中每孔鋪板8 × 104 eLa細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測。 24 h后，用PB洗3次。將Cy3標(biāo)記的終濃度為100 nmol/L的DNsCy3分別和細(xì)胞在MEM （FB+，即含有FB）或MEM（FB-，即不含有FB）中孵育2、4、6、8和12 h。到達(dá)特定時間點后，用PB洗3次去除細(xì)胞外四面體，使用流式細(xì)胞儀檢測測在FB存在和不在的條件下，細(xì)胞對DNsCy3的攝取量。用Dio染膜10 min，PB洗滌3次，更換新的MEM（FB-）培養(yǎng)基，采用共聚焦顯微鏡成像分析DNsCy3在細(xì)胞內(nèi)攝取量和分布＼[18＼]。

26DNs的攝取途徑

eLa細(xì)胞鋪板24 h后，用PB洗3次，加入材料前使用抑制劑ucrose（450 mmol/L）和MβCD（10 mmol/L）孵育30 min，然后再與DNsCy3孵育6 h。

27激光共聚焦顯微成像

細(xì)胞內(nèi)的熒光信號采用配備活細(xì)胞系統(tǒng)的Lecia C P8激光共聚焦顯微鏡成像。Cy3標(biāo)記的DNs采用561 nm氦氖激光器激發(fā)，檢測通道設(shè)置為570～620 nm。Dio標(biāo)記的細(xì)胞膜采用488 nm氬離子激光器激發(fā)，檢測通道設(shè)置為500～550 nm。采用NA=140 63X的油鏡成像。

28流式細(xì)胞儀檢測條件

采用流式細(xì)胞儀檢測前，去除細(xì)胞中培養(yǎng)基，用PB洗滌3次。每孔加入02 μL胰蛋白酶，37℃消化1 min后，加入300 μL的培養(yǎng)基終止消化。通過前散射和橫向散射確定細(xì)胞的大小和密度以圈定細(xì)胞。平行進(jìn)行3組樣品測定，每次采集10000個細(xì)胞，Gate>85%。

3結(jié)果和討論

31DNs納米結(jié)構(gòu)的合成、純化和表征

本課題組之前的工作中發(fā)現(xiàn)，邊長20 bp的DNA四面體負(fù)載CpG在RW264細(xì)胞中可引發(fā)免疫效應(yīng)＼[15＼]，但培養(yǎng)環(huán)境對這種尺寸的DNs與細(xì)胞相互作用的影響還不清楚。本研究考察了血清對DNs細(xì)胞攝取行為的影響。首先，將4條邊長63個堿基的DNA單鏈通過自組裝得到邊長20 bp的DNs納米結(jié)構(gòu)。然后，采用非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）對自組裝得到的DNs產(chǎn)率進(jìn)行表征。如圖1A所示，對應(yīng)20 bp DNA marker位置＼[14＼]，最下方的條帶為DNs。盡管DNs單體產(chǎn)率很高（大于50%），在目標(biāo)條帶上方依然存在低遷移率的四面體多聚體和錯配結(jié)構(gòu)。為了消除除其它結(jié)構(gòu)對后續(xù)實驗的干擾，使用分子排阻色譜（ECPLC）系統(tǒng)對合成后的產(chǎn)物進(jìn)行純化。如圖1B所示，多聚體和錯配結(jié)構(gòu)分子量大，出峰早于單體結(jié)構(gòu)。在92 min處收集單體，使用超濾管（MWCO=30 kDa）濃縮和置換緩沖液＼[19＼]。濃縮置換后的產(chǎn)物，單體DNs的比例超過95%（圖1C）。激光粒度儀的測量結(jié)果顯示，單體DNs的水合半徑為（121±23） nm，表面Zeta電勢為

ymbolm@@ 529 mV（圖1D）。AFM掃描的圖像顯示，DNs為大小均一、中空的單顆粒結(jié)構(gòu)（圖1E）＼[20＼]。

32DNs結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

DNs結(jié)構(gòu)的完整性直接影響其生物學(xué)應(yīng)用。分別將DNs在含有FB的培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液中孵育，用PAGE對完整的DNs進(jìn)行了定量表征。由圖2A可見，DNA納米結(jié)構(gòu)在細(xì)胞裂解液中經(jīng)過12 h孵育，依然有90%的單體DNA穩(wěn)定存在； 在含有FB的培養(yǎng)基中，孵育12 h后，完整DNs結(jié)構(gòu)的比例也超過80%，表明DNs結(jié)構(gòu)在生物體系中具有良好的穩(wěn)定性。為了考察環(huán)境中的蛋白分子是否會對標(biāo)記的Cy3熒光的強度產(chǎn)生影響，我們分別測量了FB+和FB-條件下培養(yǎng)基中DNsCy3的熒光強度，結(jié)果表明在24 h內(nèi)FB不影響Cy3熒光的強度（圖2B）。

33FB對細(xì)胞攝取DNs的速度的影響

使用激光共聚焦顯微鏡對FB+和FB-條件下eLa細(xì)胞攝取DNsCy3的情況進(jìn)行了分析，并通過流式細(xì)胞儀測量了不同時間點下DNsCy3的內(nèi)吞量（圖3）。結(jié)果表明，在12 h內(nèi)隨時間的延長，DNs在細(xì)胞內(nèi)累積并逐漸向核周圍聚集。進(jìn)一步對比兩種條件下不同時間點攝取的差異，發(fā)現(xiàn)在2 h時，兩者不存在差別，而在4 h后FB+組的DNs攝取量遠(yuǎn)高于FB-組，且差別逐漸增加（圖3A）。在細(xì)胞成像實驗中，使用Dio染色細(xì)胞膜，實驗結(jié)果清晰地證明了紅色的DNsCy3并未吸附在綠色的細(xì)胞膜上，因而，熒光強度的差別確實反映了細(xì)胞攝取量的差別（圖3B）。流式細(xì)胞和共聚焦成像實驗顯示，培養(yǎng)基中的FB增加了細(xì)胞對DNs的攝取速度。

34FB對細(xì)胞攝取DNs途徑的影響

為了進(jìn)一步研究攝取速度的差別是否由攝取途徑的不同造成的，使用抑制劑的方法研究在FB+和FB-的條件下，DNs攝取途徑的差異＼[21＼]。細(xì)胞對納米材料的攝取途徑主要是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，而受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑主要分為3種：網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和兩種都不依賴的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑＼[22，23＼]。本課題組之前的研究工作發(fā)現(xiàn)，DNA納米結(jié)構(gòu)在FB存在的情況下，是通過小窩蛋白（Caveolin）介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，網(wǎng)格蛋白相關(guān)抑制劑并不能減少細(xì)胞對DNA納米結(jié)構(gòu)的攝?。躘14＼]。本研究考察了DNs在FB存在和不存在的條件下的攝取途徑的變化情況。

為了研究這兩種途徑在DNs進(jìn)入細(xì)胞的過程中所起的作用，分別采用兩種途徑的抑制劑選擇抑制其中的一條途徑，觀察攝取量的變化。MβCD能夠去除細(xì)胞膜膽固醇、影響脂筏、破壞小窩蛋白小泡的形成，進(jìn)而抑制小窩蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑； 而蔗糖是網(wǎng)格蛋白依賴途徑的抑制劑＼[23＼]。實驗結(jié)果表明，在蔗糖作用下，DNs攝取量相對于對照組沒有減少； 而在MβCD處理后，不論是否存在FB，DNs攝取量都大幅減少（圖4A）。從共聚焦顯微鏡圖可見，MβCD抑制DNs進(jìn)入細(xì)胞，有很多DNs殘留在細(xì)胞膜表面和Dio共定位，MβCD的抑制效果超過FAC得到的抑制比例（圖4B）。對比DNs在FB+和FB-中被MβCD的抑制效果發(fā)現(xiàn)，DNs在FB+中相對于對照組下降比例更高，更容易受到抑制劑影響。抑制劑的實驗結(jié)果表明，血清不改變細(xì)胞攝取ela細(xì)胞的途徑。

4結(jié) 論

已有研究表明，環(huán)境因子對無機納米材料的細(xì)胞學(xué)行為具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。本研究選取DNs為代表性的DNA納米材料，結(jié)合激光共聚焦顯微成像和流式細(xì)胞術(shù)，定性和定量地研究了細(xì)胞培養(yǎng)液中的FB對于細(xì)胞攝取DNs的行為的影響。結(jié)果表明，盡管FB并未改變DNs攝取途徑（小窩蛋白介導(dǎo)的受體內(nèi)吞），但明顯加速了DNs的攝取速度，證明DNA納米材料進(jìn)入細(xì)胞的過程可以被培養(yǎng)環(huán)境中的蛋白等生物分子所調(diào)控的。本研究結(jié)果為以DNs為基礎(chǔ)的DNA納米載體的進(jìn)一步設(shè)計和優(yōu)化提供了參考。

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