胡濤++楊帆++楊秀榮

摘要 利用雙偏振極化干涉（Dual polarization interferometry，DPI）測量技術(shù)實(shí)時研究了三磷酸腺苷（AP）與其適配體（APbinding aptamer， ABA）間的相互作用。將單鏈ABA固定在DPI氮化硅芯片上，采用DPI技術(shù)實(shí)時監(jiān)測AP與固定的ABA的相互作用過程中敏感層的質(zhì)量、厚度、密度的變化。通過詳細(xì)分析敏感層質(zhì)量變化，得到AP與ABA間的結(jié)合速率常數(shù) （ka=466 × 103 L/（mol·s）、解離速率常數(shù)（kd =170 × 10 ymbolm@@ 2·s ymbolm@@ 1）、結(jié)合常數(shù) （KA=27 × 105 L/mol）和解離常數(shù)（KD =37 × 10 ymbolm@@ 6 mol/L）。通過測定敏感層質(zhì)量、厚度和密度隨AP濃度的變化，分別建立了測定AP的方法，檢出限（LOD， 3σ）分別為022 μmol/L（質(zhì)量變化）、014 μmol/L（厚度變化）、032 μmol/L（密度變化）。本研究利用DPI技術(shù)揭示了ABA與AP相互作用中結(jié)構(gòu)變化的實(shí)時信息，構(gòu)建了新型AP傳感器，用于實(shí)際血清樣品中AP的檢測，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 雙偏振極化干涉； 核酸適配體； 三磷酸腺苷； 相互作用

1引 言

核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（ELEX）技術(shù)，從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中篩選出的DNA或RNA寡聚核苷酸＼[1＼]。核酸適配體對相關(guān)配體具有高特異性和高親和性，與抗體相比，適配體具有免疫原性低、靶分子范圍廣、價格低廉、可快速體外合成以及容易修飾等優(yōu)點(diǎn)。因此，基于核酸適配體構(gòu)建的生物傳感器在蛋白質(zhì)研究＼[2＼]、藥物檢測＼[3＼]、臨床診斷＼[4＼]等方面得到了廣泛應(yīng)用。研究核酸適配體與靶分子間的相互作用過程，對于研究其相互作用機(jī)理，構(gòu)建適配體傳感器，具有重要的參考意義。高效液相色譜＼[5＼]、原子力顯微鏡＼[6＼]、電泳＼[7＼]、聚合酶鏈反應(yīng)＼[8＼]、等溫滴定量熱法和熒光光譜技術(shù)＼[9，10＼]都被用來研究適配體和靶分子間的相互作用過程。盡管上述技術(shù)能夠在天然狀態(tài)下測定二者的相互作用信息，并且具有較高的選擇性和靈敏度，但難以提供適配體與目標(biāo)物結(jié)合過程中的實(shí)時動態(tài)參數(shù)信息。近年來，表面等離子體共振（urface plasmon resonance， PR）被廣泛用于分析生物分子如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)＼[11＼]、適配體與靶標(biāo)＼[12＼]、蛋白質(zhì)與金屬離子＼[13＼]間等相互作用，可在線連續(xù)實(shí)時檢測相互作用過程，提供實(shí)時的動力學(xué)信息。但是PR技術(shù)僅僅是通過折射系數(shù)的變化進(jìn)行測量，主要反映結(jié)合過程中質(zhì)量的變化，無法獲得生物分子的構(gòu)象變化等信息。

雙偏振極化干涉（Dual polarization interferometry， DPI）測量技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新型表面分析方法。基于homas Young干涉原理，在傳感片（感應(yīng)波導(dǎo)片和參考波導(dǎo)片）表面發(fā)生分子相互作用或者吸附效應(yīng)時，入射光經(jīng)兩個波導(dǎo)片，傳播速率發(fā)生改變，導(dǎo)致由兩個波導(dǎo)片射出的干涉條紋位置發(fā)生變化。根據(jù)麥克斯韋方程，通過測量相位的變化，可以獲得精確的表面層厚度和折射率的變化＼[14＼]。DPI技術(shù)主要用于對表面分子間的相互作用過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和定量分析，無需標(biāo)記，能夠高精度地測量界面層厚度（001 nm）、質(zhì)量（01 pg/mm2）和密度的變化＼[15＼]。DPI在DNA固定和雜交＼[16＼]、蛋白質(zhì)相互作用過程中的構(gòu)象變化＼[17＼]、DNA/蛋白質(zhì)和小分子之間的相互作用＼[18＼]和生物標(biāo)志物的檢測＼[19＼]等界面化學(xué)、生物分子相互作用及定量檢測等方面得到越來越多的應(yīng)用，是研究分子間相互作用的有力工具。

三磷酸腺苷（AP）在細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要的作用，為生物體中的各種生化反應(yīng)，如DNA復(fù)制、生物合成、膜離子通道泵、激素和神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)等提供能量＼[20＼]。異常的AP水平與心血管疾病、帕金森氏病和阿爾茲海默氏病密切相關(guān)＼[21＼]。深入了解AP與其相應(yīng)適配體（ABA）＼[22＼]間的相互作用過程及準(zhǔn)確測定AP，對于了解機(jī)體代謝過程、預(yù)防疾病至關(guān)重要。本研究利用DPI技術(shù)實(shí)時研究了AP和ABA之間相互作用過程，獲得了AP和ABA結(jié)合過程中的實(shí)時作用參數(shù)，如層質(zhì)量、層厚度、層密度的變化信息。通過DPI提供的動力學(xué)信息，更深入理解AP和ABA之間的相互作用，精確測定了APABA的結(jié)合速率和解離速率常數(shù)。目前，尚未有采用DPI技術(shù)研究APABA相互作用的文獻(xiàn)報道。此外，本研究基于ABA和DPI間的相互作用，構(gòu)建了一種DPI傳感器，用于高靈敏檢測AP。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

AnaLight Bio 200雙偏振干涉測量儀、氨基修飾的氮化硅芯片（英國Farfield ensors公司）；J810圓二色譜儀（日本Jasco公司）。

三磷酸腺苷三鈉（AP）、三磷酸鳥苷三鈉（GP）、三磷酸尿苷三鈉（UP）、三磷酸胸苷三鈉（CP）、核酸適配體（cABA： biotin5′ACC G G AG A GCG GAG AA G3′；ABA： biotin 5′ACC GG GGG AG A GCG GAG GAA GG3′）、戊二醛、鏈霉親和素（A，上海生工生物工程有限公司）。20 mmol/L risCl 緩沖溶液 （150 mmol/L NaCl， 3 mmol/L KCl， 5 mmol/L MgCl2）。實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水（18 M

ymbolWA@ ·cm，美國Millipore公司）。

22圓二色光譜實(shí)驗(yàn)

圓二色光譜 （CD）在Jasco J810圓二色光譜儀 （日本 Jasco公司）上測定。向400

ymbolmA@ L含4 μmol/L ABA的risCl 緩沖溶液中加入15 μmol/L AP，混合并反應(yīng)3 min后測量CD光譜。對照實(shí)驗(yàn)采用cABA代替ABA，以同樣方法測定。光譜測量范圍為210～350 nm，掃描速度為200 nm/min，測量溫度為室溫。

23ABA的固定

將氨基修飾的氮化硅芯片安裝在DPI儀器上，使緩沖液以50

ymbolmA@ L/min的流速流過芯片表面?；€穩(wěn)定后，分別注射已知折射率的80%（V/V）乙醇溶液和超純水進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。設(shè)定緩沖液的流速為20 ymbolmA@ L/min， 基線穩(wěn)定后，加入200 ymbolmA@ L 2%（V/V）戊二醛溶液，10 min 后切換回緩沖溶液。待基線穩(wěn)定后，注射200 μL 05 mg/mL A溶液，10 min 后切換回緩沖溶液。待基線穩(wěn)定后，注射200 ymbolmA@ L 4 μmol/L ABA，10 min 后切換回緩沖溶液，測定DPI信號。

24DPI測定AP與固定的ABA的相互作用

在固定ABA的DPI芯片上，注射不同濃度的AP，流經(jīng)芯片表面且保持5 min。每次注射完AP后，向傳感片表面注射 20 μL 10 mol/L NaCl 溶液，使傳感片表面得到再生。實(shí)驗(yàn)完成后，原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由 AnaLight Bio200 分析軟件進(jìn)行處理。由橫電場（E）和橫磁場（M）的數(shù)據(jù)解析可以得到界面層厚度（hickness）和折射率（Refractive index，RI）變化。折射率 RI與層密度成比例，根據(jù)方程（1）可計算得到層密度＼[23＼]：

其中， ρL 為層密度（g/cm3）； nL和nbuffer 分別為敏感層和緩沖液的折射率；dn/dc 是折射率增量（RI increments，cm3/g），取值 0175。界面層質(zhì)量則由層厚度和密度計算，根據(jù)方程（2）可得單位面積質(zhì)量：

其中， mL為單位面積質(zhì)量（ng/mm2）； τL為層厚度（nm）。

3結(jié)果與討論

31DPI實(shí)時監(jiān)測ABA的固定過程

AP適配體傳感界面的構(gòu)建過程如圖1所示。首先將鏈霉親和素修飾到戊二醛（GA）預(yù)處理過的芯片表面上（A的氨基與GA的醛基作用）。然后，通過生物素和鏈霉親和素間的特異性結(jié)合將生物素修飾的AP適配體（Biotinlyted ABA）固定在芯片表面。構(gòu)建完成的適配體傳感界面不僅可以研究AP和ABA之間的實(shí)時相互作用過程，還可用于檢測AP。

適配體傳感界面修飾過程中，表面層質(zhì)量、層厚度、層密度的實(shí)時變化情況如圖2A所示，當(dāng)GA流經(jīng)芯片表面時，層厚度、層質(zhì)量和層密度均迅速增加。GA注射結(jié)束，切換到緩沖溶液后，表面層質(zhì)量和層厚度先呈下降趨勢，一段時間后到達(dá)穩(wěn)定水平。這是由于非特異性吸附的物質(zhì)或者固定不牢固的GA被緩沖液沖洗掉所致。當(dāng)A流經(jīng)芯片表面時，層質(zhì)量和層厚度在初始階段迅速增加，說明A通過氨基與芯片表面醛基結(jié)合被固定在芯片表面；隨后，層質(zhì)量、層厚度和層密度緩慢變化至平衡，表明A在芯片表面的結(jié)合趨于穩(wěn)定。停止注射A后，芯片表面層質(zhì)量、層厚度緩慢減小，最終達(dá)到穩(wěn)定，而層密度輕微增加，說明A在芯片表面的結(jié)合很牢固，只有小部分A流失。當(dāng)BioABA流經(jīng)芯片表面時，層厚度和層質(zhì)量隨時間呈線性方式增加，同時層密度線性減小。當(dāng)切換回緩沖溶液后，層質(zhì)量、層厚度及層密度均發(fā)生輕微變化，然后保持穩(wěn)定狀態(tài)，說明BioABA固定在芯片表面。此外，以密度（即單位質(zhì)量負(fù)載量）分別對層厚度和層密度變化做圖。GA、A、BioAP被引入到芯片表面層的實(shí)時變化過程如圖2B和圖2C所示。每個固定層的質(zhì)量、厚度和密度詳細(xì)參數(shù)示見表1（電子版文后支持信息）。根據(jù)表1，A的結(jié)合質(zhì)量約為122 ng/mm2，相當(dāng)于結(jié)合了約110×1010個/mm2分子，與文獻(xiàn)＼[24＼]報道的結(jié)果相似；ABA的結(jié)合質(zhì)量為022 ng/mm2，相當(dāng)于在A表面上固定13×1010個/ mm2分子。完整的A分子表面有4個生物素結(jié)合位點(diǎn)，由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推算出1個A分子約結(jié)合了13個ABA分子，表明A與ABA分子的結(jié)合并未達(dá)到飽和狀態(tài)，此種結(jié)合模式減小了空間位阻，可以使ABA更靈活地與AP發(fā)生相互作用。

32APABA的特異性結(jié)合

圓二色譜（Circular dichroism， CD）可以表征DNA二級結(jié)構(gòu)變化，是研究目標(biāo)物對靶DNA構(gòu)型變化影響的有效工具＼[25＼]。本研究利用CD技術(shù)考察AP與ABA結(jié)合時ABA的構(gòu)型變化。如圖3A所示，不加入AP時，ABA在約260 nm處出現(xiàn)正CD光譜條帶，在240 nm附近出現(xiàn)負(fù)CD光譜條帶；加入AP后，ABA在280 nm附近出現(xiàn)正CD光譜條帶，255 nm附近出現(xiàn)負(fù)CD光譜條帶。上述光譜變化表明，AP能夠與ABA結(jié)合，且誘導(dǎo)ABA形成反向平行G4結(jié)構(gòu)＼[26＼]。利用DPI技術(shù)研究了AP和ABA之間的特異性結(jié)合，首先對ABA進(jìn)行探究，對照 ABA（Control ABA，cABA）的整個固定過程如圖1（電子版文后支持信息）所示。當(dāng)ABA和cABA界面層同時引入一定濃度的AP后，cABA表面的層質(zhì)量并未發(fā)生明顯變化，而ABA固定表面對AP產(chǎn)生了明顯的質(zhì)量變化信號（圖3B），表明AP對ABA具有良好的特異性。分別將AP、CP、UP、GP及4種核苷酸的混合物流經(jīng)ABA傳感表面，如圖2（電子版文后支持信息）所示，只有AP和同時含有4種核苷酸的混合物才能引起表面層質(zhì)量的變化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABA對AP呈現(xiàn)出良好的選擇性。

33DPI實(shí)時監(jiān)測APABA相互作用

將ABA固定在芯片表面上，ABA傳感界面注射不同濃度的AP （025～1500 μmol/L），利用DPI實(shí)時監(jiān)測ABA與AP相互作用時的層質(zhì)量、層厚度及層密度的變化過程。如圖4A和4B所示，0～50 s，界面層的質(zhì)量和厚度變化迅速增加； 50～300 s，層質(zhì)量和層厚度的變化呈輕微增加的趨勢。當(dāng)停止引入AP后（300 s），層質(zhì)量和層厚度快速下降， 并最終達(dá)到平衡狀態(tài)，表明絕大部分AP與ABA傳感界面結(jié)合不穩(wěn)固。圖4C中密度的變化呈現(xiàn)出相反趨勢，因?yàn)樾酒砻娌粩嘟Y(jié)合AP導(dǎo)致界面層的密度降低。通過分析層質(zhì)量、層厚度、層密度變化發(fā)現(xiàn)，AP在初始階段能夠快速且大量地結(jié)合ABA；停止加入AP后，由于ABAAP復(fù)合物的不穩(wěn)定性，隨著緩沖溶液的引入， AP不斷解離，并離開芯片表面。上述結(jié)果表明，ABA和AP的結(jié)合具有可逆性，準(zhǔn)確測定二者之間的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)，對深入了解兩者的相互作用具有重要意義。

34動力學(xué)參數(shù)的測定

ABAAP結(jié)合過程中層質(zhì)量的實(shí)時變化見5A。當(dāng)AP流經(jīng)ABA傳感界面時，ABA先快速捕獲AP，然后再以緩慢的速率結(jié)合。切換回緩沖液時，層質(zhì)量信號顯著下降，且最終達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，表明APABA復(fù)合物出現(xiàn)了解離現(xiàn)象。根據(jù)層質(zhì)量變化的曲線（圖3A），ABAAP的結(jié)合速率常數(shù)（ka）和解離速率（kd）根據(jù)可由式（3）計算出＼[27＼]：

可以變換為：

其中，ka和kd分別表示結(jié)合和解離的速率常數(shù)； C是流過ABA界面的AP濃度， Rmax是ABA與AP的最大結(jié)合信號， R表示在時間t時ABA界面捕獲的AP數(shù)量。基于方程（4），以dR/dt對R作線性圖，斜率為：

根據(jù)圖4A中層質(zhì)量的變化曲線，在 125～200 s內(nèi)，每25 s取一個對應(yīng)的R值。根據(jù)式（4），以dR/dt對R作圖，可以獲得不同濃度的AP對應(yīng)的斜率值（圖3，電子版文后支持信息）。根據(jù)式（5），用不同濃度的AP溶液的響應(yīng)值進(jìn)行線性擬合，得到方程Y=466×103C + 170×10

ymbolm@@ 2， R2 = 0977，計算得ka=466×103 L/（mol ·s）（圖5B）。同時，從上述方程的截距可得kd=170 ymboltB@ 10

ymbolm@@ 2 s ymbolm@@ 1。根據(jù)公式KA=ka/kd，KD = kd/ka，KA和KD分別為27 × 105 L/mol和37 × 10 ymbolm@@ 6 mol/L，與文獻(xiàn)＼[22，28＼]報道的結(jié)果一致。

35AP的檢測

基于以上的研究結(jié)果，利用構(gòu)建的ABA修飾芯片，建立了一種新型傳感技術(shù)用于檢測AP。

由圖3B和圖2（見電子版文后支持信息）可知，此傳感器具有良好的特異性和選擇性。圖5A中300 s處的層質(zhì)量、層厚度和層密度對AP濃度作圖。如圖6所示，當(dāng)AP的濃度在025～1500 μmol/L范圍內(nèi)增加時，層質(zhì)量隨之增加，將300 s處不同濃度AP在芯片表面引起的層質(zhì)量變化對濃度進(jìn)行線性擬合，得到擬合方程為Y=138×10 ymbolm@@ 3 + 323×10 ymbolm@@ 3C（μmol/L）（R2 = 0996），檢出限為022 μmol/L（3σ），優(yōu)于文獻(xiàn)＼[29～31＼]報道的結(jié)果。根據(jù)層厚度和層密度的變化也可以檢測AP，檢出限分別為014和032 μmol/L（圖4，電子版文后支持信息）。

為進(jìn)一步證明此傳感器的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，對血清樣品進(jìn)行了檢測。5%血清樣品（血清用risCl 緩沖溶液稀釋20倍），加入不同濃度AP，用DPI檢測。從表1和圖5 （見電子版文后支持信息）中結(jié)果可見，加標(biāo)回收率在967%～1100%之間，表明了此傳感方法在實(shí)際血清檢測中具有潛在應(yīng)用價值。

4結(jié) 論

采用DPI實(shí)時研究了AP與ABA結(jié)合過程中層質(zhì)量、層厚度及層密度的變化情況。結(jié)果表明，ABA與AP之間的結(jié)合具有可逆性。根據(jù)相互作用過程中層質(zhì)量的變化，測得相互作用的速率常數(shù)ka （466 × 103 mol/L ymbolm@@ 1·s ymbolm@@ 1）、kd （170 × 10 ymbolm@@ 2·s ymbolm@@ 1）以及結(jié)合常數(shù)KA （27 × 105 L/mol）和KD（37 ×10 ymbolm@@ 6 mol/L）。 同時，基于DPI和ABA，建立了一種新型AP傳感器，通過測定層質(zhì)量、厚度和密度隨AP濃度的變化，傳感器的檢出限（LOD， 3σ）分別為022、014和032 μmol/L。 DPI作為一種無標(biāo)記、實(shí)時、快速、靈敏的技術(shù)，不僅能夠在納米尺度研究生物分子間的相互作用，而且在生物傳感領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。

References

1Bock L C， Griffin L C， Latha J A， Vermaas E ， oole J J Nature， 1992， 355（6360）： 564-566

2Zhang X F， ZANG ， Xu X， un Y Analyst， 2014， 139（1）： 133-137

3Kong R M， Zhang X B， Chen Z， an W mall， 2011， 7（17）： 2428-2436

4WANG Li， YE ua， ANG ongQing， WANG DanDan Chinese J Anal Chem， 2016， 44（5）： 799-803

王 麗， 葉 華， 桑宏慶， 王丹丹 分析化學(xué)， 2016， 44（5）： 799-803

5agestam I ， Pinkerton C Anal Chem， 1985， 57（8）： 1757-1763

6Nguyen ， teinbock L J， Butt J， elm M， Berger R J Am Chem oc， 2011， 133（7）： 2025-2027

7Garner M M， Revzin A Nucleic Acids Res， 1981， 9（13）： 3047-3060

8Williams K P， Liu X ， chumacher N， Lin Y Proc Natl Acad ci UA， 1997， 94（21）： 11285-11290

9Pagano B， Martino L， Randazzo A Giancola Biophys J， 2008， 94（2）： 562-569

10Yamana K， Ohtani Y， Nakano ， aito I Bioorg Med Chem Lett， 2003， 13（20）： 3429-3431

11WANG ManLi， MING uaMi， YIN ongZong， XU Kun Chinese J Anal Chem， 2014， 42（1）： 53-58

王曼麗， 明華蜜， 尹洪宗， 徐 坤 分析化學(xué)， 2014， 42（1）： 53-58

12Williams K P， Liu X ， chumacher N， Lin Y Proc Natl Acad ci UA， 1997， 94（21）： 11285-11290

13Peter F， Christelle ， Olivia B Inorg Chem， 2013， 52（21）： 12193-12206

14Lillis B， Manning M， Berney ， urley E， Mathewson A， heehan M M Biosens Bioelectron， 2006， 21（8）： 1459-1467

15Escorihuela J， GonzalezMartinez M A， LopezPaz J L， Puchades R， Maquieira A， GimenezRomero D Chem Rev， 2015， 115（1）： 265-294

16Lin M， Lee C K， Lin Y ， Lee Y， heu B C， sai J C， su M Biosens Bioelectron， 2006， 22（2）： 715-721

17Karim K， aylor J D， Cullen D C Anal Chem， 2007， 79（8）： 3023-3031

18Wang J， Coffey P D， wann M J， YANG F Lu J R， Yang X R Anal Chem， 2010 82（13）： 5455-5462

19Zheng Y， u ， Chen C X， Yang F， Yang X R Chem Commun， 2015， 51（26）： 5645-5648

20Das B K， lili C， Badhulika ， Cella L N， Chen W， Mulchandani A Chem Commun， 2011， 47（13）： 3793-3795

21Nakano ， Fukuda M， amura ， akaguchi R， Nakata E， Morii J Am Chem oc， 2013， 135（9）： 3465-3473

22uizenga D E， zostak J W Biochemistry， 1995， 34（2）： 656-665

23De Feijter J A， Benjamins J， Veer F A Biopolymers， 1978， 17（7）： 1759-1772

24Berney ， Oliver K Biosens Bioelectron， 2005， 21（4）： 618-626

25wann M J， Peel L L， Carrington ， Freeman N J Anal Biochem， 2004， 329（2）： 190-198

25Kim B， Jung I ， Kang M， him K， Woo Y J Am Chem oc， 2012， 134（6）： 3133-3138

27Karlsson R， Michaelsson A， Mattsson L J Immunol Methods， 1991， 145（12）： 229-240

28anghavi B J， itaula ， Griep M ， Karna P， Ali M F， wami N Anal Chem， 2013， 85（17）： 8158-8165

29PerezRuiz ， MartinezLozano C， omas V， Martin J Anal Bioanal Chem， 2003， 377（1）： 189-194

30Wang J， Wang L ， Liu X F， Liang Z Q， ong P， Li W X， Li G X， Fan C Adv Mater， 2007， 19（22）： 3943-3946

31Guo Y ， un X F， Yang G X， Liu J Chem Commun， 2014， 50（57）： 7659-7662