吳超+朱衛(wèi)豐+嵇琴+周瑩+章明+黃鑫+彭淑紅

[摘要] 探討女貞子對大鼠肝臟細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性的影響及可能的DNA甲基化機制。實驗采用女貞子的水提物按2.0 g·kg^-1和6.0 g·kg^-1灌胃大鼠30 d，處死大鼠后，取肝臟測定COX活性、COX的亞基之一COX4I1蛋白濃度、測定Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表達水平、TET1和DNMT3A的蛋白水平以及檢測Cox4i1DNA甲基化頻率。結(jié)果顯示女貞子低劑量和高劑量能顯著性升高COX的活性和COX4I1的濃度（P<0.05）；有降低TET1蛋白和DNMT3A的蛋白表達量的趨勢；但未顯著改變Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表達。與空白對照組相比，女貞子高劑量組甲基化頻率有降低的趨勢但未達到顯著水平。該研究表明：女貞子對大鼠肝臟的COX酶活性有促進作用，其可能通過促進COX4I1的蛋白量增加實現(xiàn)；女貞子對DNMT3A的蛋白表達有降低趨勢，其可能是Cox4i1DNA甲基化頻率有降低趨勢的原因。女貞子對于DNMT3A和TET1的蛋白表達可能有同向調(diào)節(jié)作用，具體機制仍不明確。

[關(guān)鍵詞] 女貞子； 能量代謝； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

[Abstract] The study aims to investigate the effect of Ligustri Lucidi Fructus on cytochrome c oxidase（COX） activity in rat hepatic tissues and explore its possible mechanism of DNA methylation. Male SD rats received aqueous extract of Ligustri Lucidi Fructus （2.0，6.0 g·kg^-1） by intragastric administration for 30 d. After the rats were sacrificed， hepatic tissues of rats were taken to detect COX activity， protein concentration of COX4I1， TET1 and DNMT3A protein levels， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1， and determine the DNA methylation frequency of Cox4i1.Results showed that both low and high doses of Ligustri Lucidi Fructus could significantly increase COX activity and concentration of COX4I1（P<0.05）， with a decreasing tendency of both TET1 protein and DNMT3a protein expression； however， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1 were not significantly changed by Ligustri Lucidi Fructus. In addition， DNA methylation frequency of Cox4i1 in high dose group showed a declining tendency as compared with the blank control group， but without significant difference.These results indicated that Ligustri Lucidi Fructus had promotive effect on hepatic COX activity in rats， which may be achieved by increasing protein content of COX4I1. Moreover， a decreased tendency of DNMT3A protein could be one of the reasons for the lower trend of Cox4i1 methylation rate. In addition， Ligustri Lucidi Fructus may regulate the expression levels of DNMT3A and TET1 in the same direction and its mechanism is not clear.

[Key words] Ligustri Lucidi Fructus； energy metabolism； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

女貞子為木犀科植物女貞Ligustum lucidum的干燥成熟果實，其性涼，《本草綱目》記載其具有養(yǎng)陰氣，平肝火的作用。很多研究結(jié)果都表明寒涼藥有抑制能量代謝的作用[1-3]。線粒體氧化磷酸化是機體能量ATP生成的主要方式之一，而細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）是線粒體呼吸鏈的末端組分，也是氧化磷酸化的重要組成部分。DNA甲基化是新興學科——表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容，是目前研究最為深入的一種表觀遺傳修飾機制，也是調(diào)控基因表達的一種重要的修飾方式。本文首先探討了女貞子對大鼠肝臟COX的活性以及其重要調(diào)節(jié)亞基COX4I1蛋白量的影響，然后從DNA甲基化角度探索女貞子對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的影響，并研究了COX調(diào)節(jié)亞基基因Cox4i1的DNA甲基化水平以及mRNA水平，以期從DNA甲基化水平探討女貞子干預COX酶活性的機制。

1 材料

1.1 藥物及試劑

女貞子購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)品批號1307007，產(chǎn)于江西，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鄧可眾副教授鑒定。細胞色素c氧化酶活性測定試劑盒（GENMED，批號11-42413-12）；細胞色素c氧化酶4亞基1檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，批號L20141023573）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20130926）；RNA保護液（天根生化科技有限公司，批號M1705）；RNA提取試劑盒（Promega公司，批號20130601）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，批號000096365）；熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，批號AK2901）；DNA提取試劑盒（Promega公司，批號0000105207）；DNA甲基化試劑盒（Epigenetics公司，批號ZRC176927）；GoTaq酶（Promega公司，批號000076225）；EastePTM凝膠及PCR回收試劑盒（批號20140201）；Peasy-T3 cloning Kit（全式金公司，批號I30807）；TET1（Y14）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批號SC-163446），二抗兔抗山羊（中杉金橋，批號2B-2306）；DNMT3A（H-295）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批號SC-20703），二抗山羊抗兔（中杉金橋，批號2B-2301）；β-actin（中杉金橋，批號：一抗TA-09，二抗2B-2305）。所用引物通過引物設(shè)計軟件oligo6自行設(shè)計，序列見表1，均由上海生工合成。

藥物制備：藥物水提液由本實驗室制備。取女貞子藥材1.2 kg加入10倍量雙蒸水，浸泡60 min，置于煎藥壺中煎藥，于沸騰后煎60 min，用紗布趁熱濾出藥液，殘渣再加入8倍量雙蒸水，于沸騰后煎煮60 min。合并2次藥液，濃縮后制成含生藥量2.9 kg·L^-1（用藥前稀釋），-20 ℃放置備用。

1.2 動物

SD大鼠，雄性，200～250 g，湖南斯萊克景達實驗動物中心提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。給予大鼠標準飼料和飲用水。

1.3 儀器

SpectraMaxPlus384全波長酶標儀；Tissuelyser-24全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技）；SIGMA3-18K高速低溫離心機（德國SIGMA公司）；熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）；梯度PCR儀（ABI Veriti）；HH-600電熱恒溫水浴鍋（金壇市萬華實驗儀器廠）；微量移液器（Eppendorf）；ChemiDoc XRS⁺化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）；SUB02水平電泳儀（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責任公司）；渦旋混勻器（IKA VORTEX2）；JD1000-3千分之一電子秤（沈陽龍騰）；IMS-70制冰機（常熟雪科）；G154TW型高壓滅菌器（美國致微儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

大鼠30只，按體重隨機分為3組，即空白對照組、女貞子低劑量組、女貞子高劑量組，每組10只。各組動物適應性喂養(yǎng)3 d之后開始灌胃給藥，灌胃容積為10 mL·kg^-1，每天1次，共給藥30 d。每天給藥劑量：女貞子低劑量生藥2 g·kg^-1，女貞子高劑量生藥6 g·kg^-1，空白對照組給予等容量的蒸餾水。

2.2 實驗取材

于實驗第30天，末次灌胃后禁食不禁水12 h，將大鼠麻醉，取出肝臟后迅速按照順序分成若干份，將提RNA的組織裝入RNA保護液中，其余肝臟組織分別用錫箔紙包好，迅速放入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠肝臟COX4I1濃度測定

準確稱量一定量肝臟組織（約0.2 g），按質(zhì)量體積比加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2 000 r·min^-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明進行肝臟COX4I1濃度的測定。

2.4 大鼠肝臟COX活性測定

準確稱量一定量肝臟組織（約0.2 g），按質(zhì)量體積比加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2 000 r·min^-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明進行肝臟COX活性的測定，組織蛋白的測定采用考馬斯亮藍法。

2.5 SYBR Green實時定量PCR檢測Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因的表達

2.5.1 mRNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取肝臟組織30～100 mg，按照Promega RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，全波長酶標儀測定RNA的純度和濃度。所提取的RNA于-80 ℃儲存?zhèn)溆?。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行cDNA合成。

2.5.2 Cox4i1，Dnmt3a，Tet1和β-actin擴增效率的檢測和基因表達量檢測 參照Kenneth[4] 的方法及文獻[2]。

2.6 Western blot檢測DNMT3A和TET1蛋白表達的影響

2.6.1 提取和測定蛋白濃度 常規(guī)方法提取肝臟和骨骼肌組織總蛋白，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。

2.6.2 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜 5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜數(shù)次。分別加入一抗，放置于4 ℃搖床孵育過夜。第2天，洗膜后加入1∶1萬辣根過氧化物酶標記的二抗（中杉金橋），室溫孵育1 h，洗膜數(shù)次。將膜放入顯色液中（TECAN），室溫下孵育1 min。放入化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影。β-actin一抗是1∶2 000，二抗是抗鼠1∶1萬，DNMT3A一抗是1∶1 000，二抗是抗兔1∶2萬，TET1一抗是1∶100，二抗是抗山羊1∶3萬。

2.6.3 分析 顯色后用Quantity one分析軟件分析條帶灰度，以目的基因的條帶灰度與內(nèi)參β-actin的灰度比值表示蛋白的表達水平。

2.7 重亞硫酸鹽法檢測基因Cox4i1 DNA甲基化頻率

2.7.1 DNA提取及重亞硫酸鹽處理和純化回收 取10～20 mg肝臟組織按Promega DNA提取試劑盒提取DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，全波長酶標儀測定DNA的純度和濃度。提取后的DNA按照Epigenetics甲基化試劑盒說明書步驟得到甲基化DNA產(chǎn)物。

2.7.2 擴增和純化回收 第一次PCR體系25 μL，甲基化DNA模板1.5 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水9 μL。反應條件：預變性94 ℃ 10 min，變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min。第2次PCR體系25 μL，第1次PCR的DNA產(chǎn)物2 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1N下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水8.5 μL。反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，65 ℃ 30 s每次循環(huán)降1 ℃及延伸72 ℃ 30 s，共10個循環(huán)。再變性每次循環(huán)94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共19個循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min，之后得到擴增后甲基化DNA產(chǎn)物，之后按照Transgen DNA回收試劑盒說明書步驟切膠回收。

2.7.3 藍白斑篩選和大腸桿菌質(zhì)粒提取 將連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將固體培養(yǎng)基上生長的白色菌落挑到加了氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后按試劑盒說明提取大腸桿菌質(zhì)粒。

2.7.4 質(zhì)粒測序 質(zhì)粒送上海生物工程公司進行測序。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。資料經(jīng)過方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)用±s表示。藥物組與對照組間的差異比較用獨立樣本的t檢驗法。

3 結(jié)果

3.1 女貞子對大鼠肝臟COX活性的影響

與對照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的COX的活性均有升高趨勢，其中低劑量女貞子組的COX活性顯著增加（P<0.05），見圖1。

3.2 女貞子對大鼠肝臟COX4I1濃度的影響

與對照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的COX4I1的濃度均有所升高，并達到了統(tǒng)計學差異（P<0.05），見圖2。

3.3 女貞子對Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表達量的影響

低劑量和高劑量女貞子對大鼠肝臟Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表達量與對照組相比，差異不明顯，見圖3。

3.4 女貞子對DNMT3A和TET1蛋白表達的影響

與對照組相比，女貞子低劑量和高劑量組的DNMT3A的蛋白表達有下降趨勢，TET1的蛋白表達有下降趨勢，見圖4，表2。

3.5 女貞子對cox4i1基因DNA甲基化頻率的影響

與對照組比較，高劑量女貞子組甲基化水平有所下降，見圖5（P=0.089）。

4 討論

線粒體是機體能量代謝的主要部位，是能量ATP的生成、利用及產(chǎn)熱作用發(fā)揮的主要場所。線粒體通過2條主要的呼吸鏈進行氧化磷酸化而產(chǎn)生ATP，為機體提供能量。細胞色素c氧化酶（COX），也稱復合體IV，它是線粒體2條呼吸鏈的共有末端組分，催化了電子從細胞色素c到氧原子的傳遞，該反應與質(zhì)子從線粒體機制泵入膜間隙偶聯(lián)，因此電子的傳遞有助于能量儲存于化學梯度中。它是線粒體氧化磷酸化的限速酶，在整個能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。而COX4是細胞色素最大的核編碼亞基。該亞基與其他一些核編碼亞基（除了Va，Vb和

VIb）位于COX酶的跨膜螺旋區(qū)。哺乳動物COX4包括COX4I1和COX4I2。本研究發(fā)現(xiàn)女貞子低劑量灌胃30 d之后能顯著提高正常大鼠肝臟COX4I1的濃度和COX活性，然而編碼該蛋白的Cox4i1的mRNA水平并沒有顯著變化。一般認為如果COX活性升高，則電子傳遞鏈將會受到干擾，會引起ATP合成上升，造成產(chǎn)熱增加，似乎違背女貞子寒涼藥抑制能量代謝。但是考慮到給藥是一個長期過程，恒溫動物必定有一個自我調(diào)節(jié)的過程，可能COX4I1蛋白量的增加就是為機體產(chǎn)生更多的熱能以維持體溫的相對恒定。Cox4i1的mRNA水平并未受到女貞子的影響，這說明女貞子可能對COX4I1蛋白的合成過程有一定的影響，而對該基因的轉(zhuǎn)錄水平影響不顯著。另外，也可能是給藥過程偏長，在給藥早期Cox4i1的mRNA水平有顯著增加，從而使其蛋白水平增加，由于蛋白的半衰期要比mRNA長，所以在最后mRNA并未顯示顯著性變化，而蛋白有顯著性改變。因此在以后的試驗中采取多時間點取材檢測，觀察藥物的時效性，可能更好反映中藥的藥效同時有益于研究藥物的作用機制。

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種重要方式，是一種可逆的基因修飾，對基因的表達具有重要的調(diào)控作用[5-6]。已報道與能量代謝有關(guān)的一些基因受到了DNA甲基化的調(diào)控。這些基因有：脂肪酸合成酶基因、NADH脫氫酶（泛醌）1β亞復合物6[NADH dehydrogenase （ubiquinone）1beta-subcomplex 6，NDUFB6]基因，丙酮酸脫氫酶復合物α亞基2（pyruvate dehydrogenase complex alpha subunit 2，PDHA2）基因，COX7A1基因，肝臟X受體α（liver X-receptor alpha）基因，過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1alpha，PGC-1α）基因，leptin基因等[7-10]。實驗發(fā)現(xiàn)四季三黃膠囊（主要由黃芩、黃柏、梔子、大黃等成分組成）可能通過提高動脈粥樣硬化（As）小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平，從而達降低血清甘油三酯（TG）水平，穩(wěn)定As斑塊的作用[11]。通常情況，基因組的高甲基化導致基因的沉默，而低甲基化促進基因的表達。本實驗中女貞子高劑量組與對照組相比Cox4i1基因甲基化水平有所下降，但是未達到顯著水平（P=0.089），這可能與統(tǒng)計樣本偏少有關(guān)（由于經(jīng)費限制，每組只選3個樣本用于BSP克隆測序）。另外該基因的mRNA水平也未出現(xiàn)顯著性改變，這說明對于Cox4i1基因甲基化水平的改變還不足于影響到其表達量的變化。盡管女貞子對DNA甲基化酶基因Dnmt3a和去甲基化酶基因Tet1的mRNA水平并沒有顯著影響，但是DNMT3A蛋白和TET1蛋白表達有下調(diào)趨勢，這說明女貞子可能對Dnmt3a和Tet1基因的翻譯水平有一定的調(diào)控作用，也同時表明女貞子可能通過某種機制同向調(diào)控了這2種蛋白的表達；而女貞子給藥組是Cox4i1基因甲基化水平有所下降，提示有下調(diào)趨勢的甲基化轉(zhuǎn)移酶可能對于Cox4i1基因的甲基化頻率有一定的降低作用。

總之，本實驗研究表明女貞子給藥30 d對正常大鼠肝臟的COX酶活性有促進作用，其可能通過促進COX4I1的蛋白量升高實現(xiàn)；而該蛋白量的增加可能不是通過調(diào)控Cox4i1的轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)；同時，有降低趨勢的甲基化酶可能對于Cox4i1甲基化頻率有一定的作用；然而，實驗也顯示女貞子對大鼠肝臟DNA甲基化酶DNMT3A的蛋白量和去甲基化酶TET1蛋白都有降低趨勢，這說明女貞子對于這2種蛋白有同向調(diào)控的作用，但其具體的調(diào)控機制需要進一步明確。

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[責任編輯 張寧寧]