崔瑩

摘要：采用超聲波法提取四方麻[Veronicastrum caulopterum （Hance） Yamazaki]總黃酮，對乙醇體積分數(shù)、液固比、提取時間、超聲功率4個因素進行考察，通過正交試驗確定了四方麻總黃酮超聲波提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)40%、液固比40∶1（mL∶g）、提取時間80 min、超聲功率280 W，該工藝條件下得到四方麻總黃酮含量為16.18 mg/g，表明4個因素對總黃酮含量的影響大小順序為液固比>乙醇體積分數(shù)>提取時間>超聲功率。

關(guān)鍵詞：四方麻[Veronicastrum caulopterum （Hance） Yamazaki]；總黃酮；提取工藝；正交試驗

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2113-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.030

Abstract： The ultrasonic extraction of flavonoids from Veronicastrum caulopterum（Hance） Yamazaki was researched，and explored influence to extracting yield by consistency of solvent， material fluid ratio，the time of extraction，and ultrasonic power. The optimum extracting process by the orthogonal test were crude drug was infused by the 40% alcohol，material fluid ratio 40∶1（mL∶g）， extraction for 80 minutes，and ultrasonic power 280 W. The pure yield of total flavonoids under the above extraction condition was 16.18 mg/g，experimental results showed that the order of different effect factors on yield was material fluid ratio>alcohol volume fraction>the time of extraction>ultrasonic power.

Key words： Veronicastrum caulopterum （Hance） Yamazaki； total flavonoids； extraction process； orthogonal experiment

四方麻[Veronicastrum caulopterum （Hance） Yamazaki]，別名山練草、魚珠草、四角草、四方青、四方消，為玄參科（Scrophulariaceae）多年生草本植物，全年可采，全草晾曬或新鮮采摘后可作藥用[1]。四方麻味苦、性寒，具有消腫止痛、清熱解毒的藥效，可用于治療淋巴結(jié)結(jié)核、流行性腮腺炎、痢疾、咽喉炎、腸炎、跌打損傷、皮膚濕疹等病癥[2，3]。

目前，關(guān)于四方麻化學成分及藥效方面的研究鮮見報道，戴航等[4]對四方麻的化學成分進行預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)其含有酚類有機酸、黃酮類、糖類、香豆素類等物質(zhì)。黃克南等[5]發(fā)現(xiàn)四方麻水提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌有一定程度的抗菌作用。超聲提取法簡捷，可免于加熱，提取速度快，總黃酮提取率高，較傳統(tǒng)的熱回流法具明顯的優(yōu)勢[6]。由于黃酮類化合物藥理活性多樣[7，8]，本試驗采用超聲波提取法對四方麻總黃酮進行提取，通過正交試驗對乙醇體積分數(shù)、液固比、提取時間、超聲功率4個因素進行考察，篩選四方麻總黃酮超聲波提取的最佳工藝條件，并測定四方麻中總黃酮含量[9，10]，以期為四方麻總黃酮應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與方法

四方麻（采自廣西省桂北，經(jīng)張九東老師鑒定為四方麻），蘆丁標準品（西安市食品藥品監(jiān)督管理局），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

BSA224S型電子天平，德國賽多利斯公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KH-400KDB型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶解并定容，作為標準品貯備液備用，貯備液濃度為0.2 mg/mL。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 貯備液于50 mL容量瓶中[11，12]，分別加入5% NaNO2 溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入4% NaOH溶液2 mL，搖勻之后用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后靜置15 min。得到蘆丁標準品溶液濃度分別為0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL，同時作空白對照。在510 nm波長條件下[9]，用紫外可見光分光光度計測定蘆丁標準品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁標準品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 單因素試驗 稱取1 g干燥的四方麻粉末，在乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%，液固比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g，下同），提取時間分別為30、40、50、60、70、80、90 min，超聲功率分別為200、240、280、320、360 W的條件下進行提取，超聲提取結(jié)束后，用真空泵抽濾得到上清液。3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)（A）、液固比（B）、提取時間（C）、超聲功率（D）4個因素，每個因素設(shè)定3個水平，按L9（34）進行正交試驗，試驗因素和水平見表1。

1.2.4 總黃酮提取率 取樣品溶液1 mL，按照“1.2.1”的方法進行顯色，同樣條件下用去離子水作空白，在510 nm波長處采用紫外分光光度計測定，帶入標準曲線方程計算提取液中總黃酮濃度，利用以下公式計算總黃酮含量。

總黃酮含量=

式中，C為測定樣液的黃酮濃度（mg/mL），V為測定樣液體積（mL），d為待測液稀釋總倍數(shù)，m為四方麻干粉的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線繪制

在510 nm波長下，采用紫外可見光分光光度計測定蘆丁標準品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁標準品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到直線回歸方程為y=30.320 0x+0.003 3（R2=0.998 3），表明蘆丁濃度在0.004～0.020 mg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖1）。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對四方麻總黃酮提取的影響 如圖2所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，四方麻總黃酮含量逐漸上升，可能是由于低體積分數(shù)的乙醇溶液對多糖、皂苷等大極性物質(zhì)的溶解性較強；當乙醇體積分數(shù)為40%，總黃酮含量達到最大，然后隨著乙醇體積分數(shù)的增大而降低，可能是由于此時小極性物質(zhì)如色素、油脂類化合物的溶解性較強，影響了四方麻黃酮類化合物的溶出，因此確定40%為乙醇最佳體積分數(shù)。

2.2.2 液固比對四方麻總黃酮提取的影響 如圖3所示，乙醇用量在20～40 mL時，由于原料和提取溶劑的接觸面積增大，四方麻總黃酮溶出量隨溶劑用量增加而增加；當液固比為40∶1時，四方麻總黃酮含量最高，然后隨著溶劑用量的增大，其他物質(zhì)的溶出量增大，抑制了總黃酮的溶出，使得總黃酮含量有所下降。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本，最適宜的液固比為40∶1。

2.2.3 提取時間對四方麻總黃酮提取的影響 如圖4所示，當提取時間為30～70 min時，隨著提取時間的增加，細胞膜破碎的數(shù)量增多，總黃酮溶出量增加，70 min后總黃酮含量呈下降趨勢，可能是由于提取時間超過70 min后，黃酮類化合物會受到相應(yīng)的破壞，同時其他物質(zhì)的溶出量增加，也不利于總黃酮的提取，因此確定70 min為最佳提取時間。

2.2.4 超聲功率對四方麻總黃酮提取的影響 如圖5所示，當超聲功率為200～280 W時，四方麻總黃酮含量隨超聲功率的增加而升高，隨后超聲功率繼續(xù)增加，總黃酮含量略有下降，可能是由于超聲功率較小時總黃酮溶解不完全，超聲功率增大，促使四方麻細胞膜破裂而有效成分溶解度增加，含量增大，隨后超聲功率過高會導(dǎo)致溶劑過熱而破壞總黃酮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此，確定280 W為最佳超聲功率。

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以乙醇體積分數(shù)、液固比、提取時間、超聲功率為影響因素，進行4因素3水平正交試驗，優(yōu)化提取工藝，根據(jù)正交試驗結(jié)果（表2），確定四方麻總黃酮提取的最佳條件，并用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，方差分析結(jié)果見表3。從表2極差分析可以看出，影響四方麻總黃酮含量的因素大小順序為液固比>乙醇體積分數(shù)>提取時間>超聲功率。通過正交試驗法確定超聲波提取四方麻總黃酮的最佳提取條件為A2B2C3D2，即乙醇體積分數(shù)40%、液固比40∶1、提取時間80 min、超聲功率280 W。從表3方差分析結(jié)果可以看出，液固比對四方麻總黃酮含量影響顯著，其他因素的影響不顯著。

2.4 重復(fù)性試驗

對優(yōu)選的工藝條件進行3次重復(fù)性試驗，即稱取四方麻干粉1 g，加入體積分數(shù)為40%的乙醇40 mL，設(shè)定超聲功率為280 W，室溫下提取80 min，該工藝下條件下總黃酮平均含量可達16.18 mg/g，RSD為0.43%。表明該工藝可行、穩(wěn)定，試驗結(jié)果可靠。

3 小結(jié)

采用超聲波法提取四方麻總黃酮，以乙醇為提取劑，由于黃酮苷元易溶于有機溶劑[13]，黃酮苷易溶于水，因此用乙醇的水溶液提取總黃酮較水作為提取劑，黃酮含量高且回收快，同時相比其他有機溶劑安全、環(huán)保、毒害小，而超聲波提取法較傳統(tǒng)的熱回流提取法簡捷、快速。正交試驗結(jié)果表明，超聲提取四方麻總黃酮的最佳工藝條件是乙醇體積分數(shù)40%、液固比40∶1、提取時間80 min、超聲功率280 W。該工藝條件下四方麻總黃酮含量為16.18 mg/g。從試驗結(jié)果可知，4個因素對黃酮含量的影響大小順序為液固比>乙醇體積分數(shù)>提取時間>超聲功率，其中液固比對總黃酮含量的影響顯著。

參考文獻：

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1999.

[2] 蔡光先.湖南藥物志[M].長沙：湖南科技出版社，2004.

[3] 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編·上冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1975.

[4] 戴 航，侯小濤，寧小清，等.中藥四方麻化學成分的預(yù)試驗[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，3（4）：209-210.

[5] 黃克南，戴 航，候小濤，等.四方麻水提取的體外抗菌試驗[J].廣西中醫(yī)學院學報，2009，12（2）：48-49.

[6] 張紀寧，歐陽艷.黃酮類化合物的提取工藝研究進展[J].伊犁師范學院學報（自然科學版），2008（2）：27-30.

[7] 劉 平，陳光輝，鄧淑華，等.金蓮花總黃酮抗菌作用的試驗研究[J].中國試驗方劑學雜志，2013，19（6）：207-210.

[8] 延 璽，劉會青，鄒永青，等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J].有機化學，2008，28（9）：1534-1544.

[9] 夏林波，董 倩，鄧仕任，等.中藥蕪花總黃酮含量測定方法研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（9）：2099-2100.

[10] 蔣俊毅，曹 凱，吳德康，等.紫外分光光度法測定杏香兔耳風制劑中總黃酮含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（3）：178-179.

[11] 王孟歌，田寶娟，喬鳳霞.山楂葉中總黃酮含量的測定[J].光譜試驗室，2006，23（4）：1-3.

[12] 張 巖，曹國杰，張 燕，等.黃酮類化合物的提取以及檢測方法的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（1）：154-158.

[13] IWASHINA T. The structure and distribution of the flavonoids in plants[J].J Plant Res，2000，113（3）：287-299.