徐紅貞　萬萍　單蘭君

摘要：候鳥分子生物學研究的前提是獲得質(zhì)量好的基因組DNA，采用標準血液DNA提取試劑盒和苯酚-氯仿法分別對采自鄱陽湖的部分候鳥血液進行基因組DNA提取。結(jié)果表明，這2種標準方法所獲得DNA質(zhì)量均不合要求，因此在苯酚-氯仿法基礎上開展優(yōu)化試驗，得到優(yōu)化后的苯酚-氯仿法提取條件為組織裂解液500 μL、血液樣品20 μL、蛋白酶K 10 μL和酶解時間8 h，在此條件下能分離到高質(zhì)量的基因組DNA。

關鍵詞：候鳥基因組；分離；優(yōu)化

中圖分類號：Q959.7；Q812 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.038

Abstract： The premise of migratory bird molecular biology is to obtain high purity and good quality genomic DNA， and the DNA extraction method of common species is not suitable for the isolation and extraction of DNA from migratory birds. The first uses standard blood DNA extraction kit and classical phenol chloroform method genomic DNA blood migratory birds in Poyang Lake were extracted. The results showed that the two standard methods for the quality of DNA are undesirable. Therefore， the optimization test in the classical phenol chloroform method carried out， found that the optimized phenol chloroform method（tissue lysates 500 μL， blood samples 20 μL， proteinase K 10 μL and enzyme hydrolysis time 8 hours），the high quality genomic DNA could obtain under the condition.

Key words： birds genome； separation； optimization

候鳥分子生物學研究的關鍵是獲取高質(zhì)量和完整的基因組DNA，目前提取基因組DNA的方法較多，實驗室提取DNA的方法主要包括苯酚-氯仿法和試劑盒法。試劑盒法是利用核酸在一定濃度溶液條件下吸附固相介質(zhì)（二氧化硅膜）的原理，在實際操作中采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異地結(jié)合在硅基質(zhì)離心吸附柱上，通過幾次洗滌除去雜質(zhì)，最后采用低鹽緩沖液洗脫獲得高純度DNA。試驗中不使用苯酚和氯仿等有毒溶劑，也無需乙醇沉淀等步驟。這種方法的優(yōu)點是操作簡便，耗時短，但其存在離子殘留量大的問題，對后續(xù)PCR擴增反應尤其是測序反應等造成嚴重干擾[1]。苯酚-氯仿法是提取基因組DNA最經(jīng)典方法，其主要原理是根據(jù)在水相與酚/氯仿有機相中DNA和雜質(zhì)的溶解度存在差異而進行分配，通過離心分離出蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再利用乙醇沉淀洗滌DNA，最后獲得DNA。該方法成本低，所用試劑均為常用試劑，提純效率高，但不足之處是耗時費力、核酸降解程度大，且所用試劑苯酚和氯仿等具有一定毒性[2]。此外還有鹽析法、樹脂法、Chelex100法、硅顆粒法、碘化鉀法等，每種方法均有優(yōu)勢和不足，有其適應范圍?？铝竦萚3]利用樹脂法、酚-氯仿抽提法、鹽析法對禽類全血基因組DNA進行提取，結(jié)果表明鹽析法適合雞全血DNA的提取，其特點是DNA的濃度和純度好，耗時短、成本低、操作簡單。陳小麟等[4]利用蛋白酶K法、Chelex100法、硅顆粒法對鳥類陳舊標本的羽毛、皮膚、骨骼組織中提取基因組DNA，結(jié)果表明Chelex100不適合鳥類標本的DNA提取，蛋白酶K法DNA的提取量大于硅顆粒法。任春環(huán)等[5]在提取山羊全血基因組DNA時，通過比較酚-氯仿抽提法和碘化鉀法，發(fā)現(xiàn)改良的Miller鹽析法操作步驟復雜，耗時更長，苯酚-氯仿法更簡便。王洪梅等[6]在提取牛的凝血塊基因組DNA試驗中，也是采用經(jīng)典苯酚-氯仿法，然后通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測，發(fā)現(xiàn)效果較好，但濃度有些偏低。曹果清等[7]利用組織DNA抽提液而非蛋白酶K對細胞進行裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提后用無水乙醇來沉淀提取DNA，經(jīng)檢測DNA的純度和濃度均較高。

目前，關于動物血液DNA的提取方法較多，但對候鳥基因組DNA的提取鮮見報道。本試驗首先采用通用型柱式基因組提取試劑盒法和苯酚-氯仿法提取候鳥基因組DNA，比較兩種方法所分離基因組DNA的質(zhì)量，篩選適宜的候鳥基因組DNA提取方法，如果結(jié)果不理想，進一步優(yōu)化苯酚-氯仿法以獲取最佳分離提取候鳥基因組DNA的方法，以期從分子生物學、遺傳多態(tài)性方面對候鳥生物特性研究提高參考，為保護瀕危候鳥奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于鄱陽湖國家自然保護區(qū)野生動物保護站采集若干只候鳥個體的血液（包括白額雁、鴻雁、豆雁、野鴨等品種），采集的血液樣品放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗試劑

CW2298禽血DNA提取試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司；Bis-Tris、EDTA和SDS，購自上海生工有限公司；Tris平衡酚，購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，購自Invitrogen中國公司；三氯甲烷，購自西隴化工股份有限公司；異戊醇和無水乙醇，購自天津市大茂化學試劑廠；蛋白酶K，購自羅氏ROCHE中國公司；RNA酶，購自北京合式金生物技術有限公司。

1.3 DNA的提取方法

1.3.1 試劑盒法 采用康為CW2298試劑盒法提取基因組DNA，試驗操作參照禽血DNA提取試劑盒說明書進行。

1.3.2 苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取基因組DNA試驗步驟：取適量鳥類抗凝血樣品，加入1 倍體積的組織裂解液，加蛋白酶K，混勻后于55 ℃水浴10 h，離心，上清液置于新的EP管，加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）（體積比）緩慢顛倒搖勻，離心，將上清液移至新EP管；加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）緩慢顛倒混勻，離心；將上清液移至新EP管，加入NaAc和無水乙醇；取白色沉淀，用70%乙醇洗滌3次，除去殘留乙醇，室溫晾干，加入TE緩沖液溶解基因組DNA，于-20 ℃保存。

1.3.3 優(yōu)化的苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取部分候鳥基因組DNA，通過檢測分析后發(fā)現(xiàn)其RNA、蛋白質(zhì)殘余量較高，有部分DNA降解，而試劑盒提取的DNA離子殘留量大，消化不徹底，有些條帶不清晰。因此，本試驗基于苯酚-氯仿法的候鳥基因組DNA提取優(yōu)化試驗，具體優(yōu)化參數(shù)如表1所示，依次進行細胞裂解液、血液量、消化時間以及蛋白酶K 4個因素的優(yōu)化試驗，且每次試驗僅改變一個影響因素，以此不斷優(yōu)化候鳥血液DNA提取試驗方案。

1.4 基因組DNA的檢測

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳 將上述3種提取方法分離的基因組DNA采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。取 2 μL稀釋后的DNA與上樣緩沖液混勻后加入0.8%瓊脂糖凝膠樣品孔中，于120 V電泳20 min，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察DNA條帶，保存圖片[8]。

1.4.2 DNA濃度測定 取1 μL提取的基因組DNA，利用ND2000超微量分光光度計測定基因組DNA 樣本的OD260 nm、OD280 nm吸光度，計算分析基因組DNA的純度和濃度[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測結(jié)果

圖1為采用禽血試劑盒提取的候鳥基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳結(jié)果，可以看出條帶亮度不一，有的甚至不清晰，且大部分條帶蛋白質(zhì)殘余嚴重，還存在拖帶現(xiàn)象。

圖2為采用苯酚-氯仿法提取的候鳥基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳結(jié)果，可見帶型不整齊，大部分條帶不清晰，有些條帶蛋白質(zhì)殘留較多，還有拖帶現(xiàn)象嚴重，可能是基因組DNA出現(xiàn)降解、蛋白酶K用量不恰當、組織裂解液用量大，消化時間過長等導致的不良現(xiàn)象。

從上述試驗結(jié)果可知，禽血DNA提取試劑盒法、苯酚-氯仿DNA提取法所分離到的樣本DNA均不理想，不合要求。為此本試驗在苯酚-氯仿法基礎上進行優(yōu)化試驗，依次對細胞裂解液、血液量、消化時間以及蛋白酶K 4個主要因素的進行優(yōu)化試驗，且每次試驗僅改變一個影響因素，優(yōu)化候鳥血液DNA提取試驗方案，最終確定優(yōu)化后的苯酚-氯仿DNA提取方案為組織裂解液為500 μL、血液樣品為20 μL、蛋白酶K為10 μL和酶解時間為8 h。采用該優(yōu)化方案進行候鳥血液DNA提取，其提取效果如圖3所示。從圖3可以看出，候鳥基因組DNA條帶總體清晰、明亮、無拖帶，且基因組DNA無降解，產(chǎn)量較高。

2.2 候鳥血液基因組DNA的濃度和純度

從表2可以看出，所提取的候鳥基因組DNA的濃度符合要求，均在20 ng/μL以上，純度A260 nm/A280 mm的比值大部分在1.80～1.90范圍內(nèi)，A260 nm/A230 nm的比值在2.00～2.50范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)表明該DNA雜質(zhì)含量少，純度較高，個別樣品A260 nm/A280 mm超過了2.00、A260 nm/A230 nm超過了2.50，但是從大量的試驗數(shù)據(jù)來分析，候鳥基因組DNA的濃度和純度之間不存在必然的聯(lián)系，濃度為20.8 ng/μL的樣品純度A260 nm/A280 mm為1.81，濃度低不一定是樣品不純造成的。因此，優(yōu)化后的苯酚-氯仿提取法提取候鳥基因組DNA的效果較好。

3 小結(jié)與討論

為了提高候鳥血液基因組DNA的提取質(zhì)量，在苯酚-氯仿提取法基礎上對反應體系進行優(yōu)化試驗，分析最優(yōu)的提取方案，細胞裂解液為500 μL、血液樣品為20 μL、蛋白酶K為10 μL和消化時間為8 h，獲得的候鳥基因組DNA濃度和質(zhì)量較高。本試驗提取了約200只候鳥（主要包括白額雁、鴻雁、豆雁、野鴨等）DNA，并取部分DNA開展了PCR擴增試驗，獲得理想的擴增效果，可用于進一步的分子生物學試驗。

候鳥是有遷徙行為、春秋兩季更換棲息地的鳥類。為了更好地從分子角度研究珍稀候鳥的遺傳、進化以及對當?shù)丶仪莸挠绊?，獲得質(zhì)量好、純度高的血液DNA是關鍵[10]。因此，有必要選擇一種快速、簡便、高效的提取候鳥血液DNA的方法。本試驗采用禽血試劑盒法和苯酚-氯仿抽提法分別提取基因組DNA，并且對這兩種方法進行比較。試劑盒法雖然簡便易操作，但得到的候鳥基因組DNA濃度和質(zhì)量較差，且離子殘留量大，影響后續(xù)候鳥分子生物學的研究[11]。苯酚-氯仿法提取的DNA電泳圖條帶模糊，雜蛋白質(zhì)殘留多，拖尾現(xiàn)象嚴重，不適合下一步研究使用。因此，在苯酚-氯仿法基礎上進一步優(yōu)化了試驗條件。鳥類紅細胞大多是呈橢圓形，有細胞核結(jié)構，因此可以直接提取基因組DNA，但為了不影響所提取基因組DNA的質(zhì)量，血液樣品的量不宜過多[12]。本試驗結(jié)果表明，當血樣樣品量為20 μL時，基因組DNA的條帶較好。組織裂解液會使血液樣品的黏度增大，影響蛋白酶K的催化活性，候鳥基因組DNA的獲取量與細胞被裂解的程度相關，當細胞裂解液為500 μL時，基因組DNA條帶整齊、集中、無拖尾現(xiàn)象。血液的消化時間是另一關鍵因素，將直接影響高質(zhì)量基因組DNA的提取，本試驗分別采用消化時間為6、8、10 h，分別提取候鳥血液基因組DNA，比較其電泳結(jié)果可知，消化時間為8 h時條帶亮度和清晰度較高，也更整齊，說明酶解8 h時的基因組DNA提取效果最好。蛋白酶K的作用是將纏繞在DNA上的蛋白質(zhì)降解為小分子的肽鏈或者氨基酸，使DNA完整分離[13]。結(jié)果表明，蛋白酶K為10 μL時，DNA條帶最好?？梢妰?yōu)化后的苯酚-氯仿抽提法可以使基因組DNA充分釋放，有效地提高DNA的濃度和質(zhì)量。

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