吳洪敏　朱秀左　馬龍雪

摘要：分別以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和大腸桿菌（Escherichia coli）的基因組DNA為模板，通過PCR技術(shù)克隆得到rd29A啟動子、otsA和otsB基因，將其依次插入到p2300-gfp質(zhì)粒中，從而構(gòu)建p2300-prd29A-otsAB融合基因表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將prd29A-otsAB融合基因?qū)氲奖旧鸁煵荩∟icotiana benthamiana）中，通過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行篩選，初步獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株，為今后進(jìn)一步研究相關(guān)基因的功能以及通過基因工程技術(shù)提高植物的抗脅迫能力奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海藻糖；prd29A；otsA基因；otsB基因；本生煙草（Nicotiana benthamiana）；農(nóng)桿菌

中圖分類號：Q943.2；S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.039

Abstract： The rd29A promoter of Arabidopsis thaliana，otsA and otsB genes in Escherichia coli were cloned by PCR respectively. Afterwards，the target fragments were ligated into plasmid p2300-gfp，which would lead to the construction of p2300-prd29A-otsAB expression vector. By Agrobacterium-mediated method，the prd29A-otsAB fusion gene was introduced into Nicotiana benthamiana，and then the transgenic Nicotiana benthamiana was obtained through the tissue culture and antibiotics screening for the first time. The experimental results can provide the reference for improving the stress resistance of plants through genetic engineering.

Key words： trehalose；rd29A promoter；otsA gene；otsB gene；Nicotiana benthamiana；Agrobacterium

土壤鹽堿化是制約農(nóng)作物生長及產(chǎn)量提高的重要因素，土壤中鹽分過高，會引起植物出現(xiàn)滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)元素虧缺等癥狀，正常的生長發(fā)育受阻[1]。植物可通過在細(xì)胞中積累某些滲透保護(hù)劑維持對水分的吸收，消除鹽脅迫所造成的傷害[2]。海藻糖為其中一類重要的滲透保護(hù)劑，由2個葡萄糖分子縮合而成[3]。目前發(fā)現(xiàn)至少有5種不同的海藻糖合成途徑，其中最為典型的是TPS/TPP途徑[4，5]。在該途徑中，6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在6-磷酸海藻糖磷酸化酶（TPP）的作用下發(fā)生去磷酸化生成海藻糖[6]。已有研究表明，轉(zhuǎn)入海藻糖合成相關(guān)基因，可以改善植物對逆境的抵御能力。將酵母TPS基因?qū)腭R鈴薯、玉米和水稻中，植物抵御干旱和鹽脅迫的能力明顯提高[7-9]。大腸桿菌otsA和otsB基因分別編碼TPS和TPP，otsAB融合基因的表達(dá)極大地提高了水稻對非生物脅迫的耐受能力[10]。過量表達(dá)AtTPS1基因，擬南芥耐旱性也得到了提高[11]。OsTPS1過表達(dá)顯著增強(qiáng)了水稻抗低溫、高鹽和干旱等逆境脅迫的能力[12]。海藻糖與植物的抗逆性密切相關(guān)，但其在植物體內(nèi)含量極低[10]。因此，如何有效地提高植物體內(nèi)海藻糖的含量，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗逆能力，已成為當(dāng)前研究的重要課題之一。

本生煙草（Nicotiana benthamiana）為重要的模式植物，但有關(guān)海藻糖在其體內(nèi)合成方面的研究鮮見報道。本試驗通過根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的葉盤法將prd29A-otsAB表達(dá)載體導(dǎo)入到本生煙草中，以期有效提高轉(zhuǎn)基因植株中海藻糖的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本生煙草和擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子，由山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101由濱州學(xué)院生命科學(xué)系基因工程實驗室保存，p2300-gfp質(zhì)粒由蘭州大學(xué)細(xì)胞研究所提供。

1.1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真PCR擴(kuò)增試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，DNA Marker 3、pTZ57R/T載體為蘭州鵬程生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Taq酶、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。篩選培養(yǎng)基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+Carb（Carbenicillin）+Kan （Kanamycin）。增殖培養(yǎng)基：MS+Carb+Kan。生根培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L NAA+Carb+Kan[2]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中擬南芥rd29A啟動子（prd29A）、大腸桿菌otsA和otsB基因序列的相關(guān)信息進(jìn)行引物設(shè)計。引物序列（下劃線代表酶切位點的位置）如下：prd29A-F（5′CGCAAGCTTAGATTTGGGGTTTTGCTTTTGAATG3′）（HindⅢ）、prd29A-R（5′GCGGAGCTCTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA3′）（SacⅠ）、otsA-F（5′GAG CTCTAGAATGAGTCGTTTAGTCGTAGT3′） （XbaⅠ）、otsA-R（5′ATAGTCGACCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG3′）（SalⅠ）、otsB-F（5′ATAGAGCTCATGACAGAACCGTTAACCGAAACC3′）（SacⅠ），otsB-R（5′GCGTCTAGAGATACTACGACTAAACGACTCATAGT 3′）（XbaⅠ）。分別以擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將prd29A、otsA和otsB分別插入pTZ57R/T，構(gòu)建pTZ57R/T-prd29A、pTZ57R/T-otsA和pTZ57R/T-otsB克隆載體。用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ-SacⅠ酶切質(zhì)粒p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，連接回收目的片段，構(gòu)建p2300-prd29A-gfp表達(dá)載體。用SacⅠ-XbaⅠ酶切連接pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，構(gòu)建p2300-prd29A-otsB表達(dá)載體。用XbaⅠ-SalⅠ酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，實現(xiàn)p2300-prd29A-otsAB融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建（圖1）。

1.2.3 抗生素敏感性試驗 將本生煙草葉片分別接種到含0、10、20、30、40、50、60和100 mg/L卡那霉素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 d后根據(jù)外植體的分化情況，確定轉(zhuǎn)基因植株合適的篩選濃度。在農(nóng)桿菌生長培養(yǎng)基和本生煙草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加羧芐青霉素（Carb），將Carb的濃度設(shè)為0、100、200、300、400、500、600和1 000 mg/L共8個水平，分別接種含p2300-prd29A-otsAB重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和本生煙草葉片，觀察農(nóng)桿菌和外植體的生長狀態(tài)和存活情況，確定轉(zhuǎn)基因植株篩選過程中去除農(nóng)桿菌合適的Carb濃度。

1.2.4 本生煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測其OD600 nm約為0.5時進(jìn)行離心，加入等量的MS基本培養(yǎng)基懸浮菌體；以本生煙草的葉片作為外植體，置于菌液中侵染3～5 min；吸干后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基，2 d后將葉片轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性芽，并在增殖培養(yǎng)基中對抗性芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)；切取合適大小的不定芽，在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性芽生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 p2300-prd29A-otsAB融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以野生型擬南芥和大腸桿菌基因組DNA為模板，高保真PCR擴(kuò)增擬南芥prd29A、大腸桿菌otsA和otsB（圖2A）。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連入pTZ57R/T載體。分別酶切p2300-gfp和pTZ57R/T-prd29A，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌。通過PCR和酶切技術(shù)對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示prd29A已連入p2300-gfp，從而實現(xiàn)p2300-prd29A-gfp表達(dá)載體的構(gòu)建（圖2B）。分別酶切pTZ57R/T-otsB和p2300-prd29A-gfp，將回收的目的片段進(jìn)行連接，鑒定重組體，表明otsB基因已插入p2300-prd29A-gfp，從而實現(xiàn)p2300-prd29A-otsB表達(dá)載體的構(gòu)建（圖2C）。分別酶切pTZ57R/T-otsA和p2300-prd29A-otsB，回收、連接目的片段，鑒定結(jié)果表明otsA基因已插入p2300-prd29A-otsB，從而實現(xiàn)p2300-prd29A-otsAB融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建（圖2D）。

2.2 抗生素對本生煙草不定芽誘導(dǎo)和農(nóng)桿菌生長的影響

將本生煙草葉片接種到含不同濃度Kan的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。30 d后在不含Kan的對照培養(yǎng)基上，外植體產(chǎn)生大量的不定芽（圖3A）；而添加Kan的培養(yǎng)基中，多數(shù)葉片變黃，難以分化（圖3B-H）。當(dāng)Kan濃度為10～20 mg/L時，少數(shù)葉片產(chǎn)生少量綠色的芽點；當(dāng)Kan濃度為30～40 mg/L時，僅有極少量細(xì)胞存活，絕大多數(shù)葉片已完全枯萎；當(dāng)Kan濃度大于50 mg/L時，葉片完全白化死亡。因此，50 mg/L可作為臨界濃度篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。Carb能有效抑制農(nóng)桿菌的生長，當(dāng)農(nóng)桿菌p2300-prd29A-otsAB接種于Carb濃度大于100 mg/L的培養(yǎng)基時，農(nóng)桿菌的生長幾乎完全受到抑制，而對照則可正常生長（圖3I、J），表明農(nóng)桿菌p2300-prd29A-otsAB對Carb極其敏感，極少量的Carb也能有效抑制根癌農(nóng)桿菌的生長。用不同濃度的Carb處理本生煙草的葉片，當(dāng)Carb濃度100～500 mg/L時，外植體不定芽誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于對照（圖3K-P）；當(dāng)Carb濃度達(dá)到600 mg/L時，抗性芽的分化受到抑制（圖3Q）；而當(dāng)Carb濃度為1 000 mg/L時，外植體嚴(yán)重白化，抗性芽的分化率明顯降低（圖3R）。因此，Carb抑制農(nóng)桿菌生長的最佳使用濃度為500 mg/L。

2.3 prd29A-otsAB融合基因轉(zhuǎn)化本生煙草

活化含prd29A-otsAB融合基因的農(nóng)桿菌，葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙草。將共培養(yǎng)2 d的外植體接種到含50 mg/L Kan和500 mg/L Carb的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性誘導(dǎo)。15 d后葉片上產(chǎn)生大量綠色的芽點，其中部分芽點已形成不定芽（圖4A）。21 d后多數(shù)芽點已生長為成簇分布的抗性芽（圖4B）。隨著培養(yǎng)時間的延長，抗性芽不斷分化，生長旺盛（圖4C-F）。將培養(yǎng)30 d的葉片轉(zhuǎn)移至含50 mg/L Kan和250 mg/L Carb增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，可獲得大量生長狀態(tài)良好的不定芽（圖4G、H）。切取不定芽，接種于添加50 mg/L Kan和250 mg/L Carb生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根（圖4I）。約30 d后，不定芽開始生根成苗。8周后抗性芽基部產(chǎn)生大量的根，試管苗生長健壯（圖4J、K）。當(dāng)根布滿瓶底，幼苗高度約8～10 cm時，便可進(jìn)行抗性苗的馴化移栽（圖4L）。

3 小結(jié)與討論

為了有效提高植物體內(nèi)海藻糖的含量，本試驗成功克隆了擬南芥rd29A啟動子、大腸桿菌otsA和otsB基因并構(gòu)建了prd29A-otsAB融合基因表達(dá)載體。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將其導(dǎo)入到受體細(xì)胞中。海藻糖是非還原性雙糖，廣泛存在于生物體內(nèi)，它不僅能為生物體的新陳代謝提供和儲存能量，而且在非生物脅迫條件下，海藻糖可以保護(hù)生物體組織和大分子的功能和活性[6]。植物在遭受逆境脅迫時，海藻糖含量提高，進(jìn)而增強(qiáng)植物對不良環(huán)境的耐受性[13]。海藻糖提高植物抗逆性的分子機(jī)制尚不清楚。已有研究表明，在植物體內(nèi)，TPS和TPP催化海藻糖的生物合成[5，6]。海藻糖合成相關(guān)基因在植物生長發(fā)育、逆境調(diào)控中具有重要作用，通過轉(zhuǎn)入海藻糖合成相關(guān)基因可以改善植物對逆境的抵御能力。將酵母TPS1基因?qū)胗衩字?，可以促進(jìn)玉米根系生長，提高脯氨酸與葉綠素含量，增強(qiáng)玉米的抗旱能力[8，9]。壇紫菜PhTPS基因在中高水平失水條件下，其表達(dá)水平可顯著上調(diào)[14]。轉(zhuǎn)大腸桿菌otsA基因的本生煙草幼苗在含有150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中生長效果明顯優(yōu)于對照[15]。

與傳統(tǒng)的抗逆育種工作相比，基因工程育種以其特有的優(yōu)勢，受到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)階段，海藻糖合成相關(guān)基因不斷被克隆并導(dǎo)入相應(yīng)的受體細(xì)胞中，但海藻糖的合成效果仍不理想，植物的抗逆效果有待于進(jìn)一步提高。外源基因在受體植物中的表達(dá)受多種因素的影響，其中啟動子在決定基因表達(dá)方面起重要作用。rd29A啟動子屬于逆境誘導(dǎo)型啟動子，植物只有在受到干旱、高鹽、低溫等脅迫時，該啟動子才驅(qū)動目的基因表達(dá)[16]。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHANG J L，SHI H Z. Physiological and molecular mechanisms of plant salt tolerance[J]. Photosynthesis Research，2013，115： 1-22.

[2] 陸玉建，張韓杰，劉南南，等.大腸桿菌otsB基因的克隆與轉(zhuǎn)化本生煙草的初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（8）：108-112.

[3] 高 超，張 山，何永志，等.改造大腸桿菌合成海藻糖途徑以高效合成海藻糖[J].生物工程學(xué)報，2015，31（12）：1784-1788.

[4] 秦加敏，羅術(shù)東，和紹禹，等.昆蟲海藻糖與海藻糖酶的特性及功能研究[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2015，37（1）：163-169.

[5] 唐 斌，徐青葉，趙麗娜，等.昆蟲海藻糖及其合成酶基因的特性與功能研究進(jìn)展[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2014，51（6）：1397-1405.

[6] 岳思思，姚 偉，王東浩，等.丹參海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SmTPS）的克隆及其表達(dá)分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014， 33（2）：357-364.

[7] YEO E T，KWON H B，HAN S E，et al. Genetic engineering of drought resistant potato plants by introduction of the trehalose-6-phosphate synthase（TPS1） gene from Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Cells，2000，10（3）：263-268.

[8] 項 陽，劉延波，秦 利，等.酵母TPS1基因促進(jìn)干旱脅迫下玉米的根系生長[J].植物生理學(xué)報，2015，51（3）：363-369.

[9] 張彥琴，董春林，楊麗莉，等.轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因玉米株系的獲得及其抗旱性研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：1-4，39.

[10] GARG A K，KIM J K，OWENS T G，et al. Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses[J]. Proc Natl Acad Sci，2002，99（25）：15898-15903.

[11] AVONCE N，LEYMAN B，MASCORRO-GALLARDO J O，et al. The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose， abscisic acid， and stress signaling[J]. Plant Physiol，2004，136：3649-3659.

[12] LI H W，ZANG B S，DENG X W，et al. Overexpression of the trehalose-6-phosphate synthase gene OsTPSl enhances abiotic stress tolerance in rice[J]. Planta，2011，234（5）：1007-1018.

[13] 劉 姣，姜大剛.作物海藻糖合成相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（2）：432-437.

[14] 史健志，徐 燕，紀(jì)德華，等.壇紫菜6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）家族基因的克隆及表達(dá)特征分析[J].水產(chǎn)學(xué)報，39（4）：485-495.

[15] 陸玉建，張韓杰，劉南南.大腸桿菌otsA基因的克隆和轉(zhuǎn)化本生煙草[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（1）：32-38.

[16] 齊恩芳，賈小霞，馬 勝，等.擬南芥誘導(dǎo)型啟動子rd29A的克隆及其功能鑒定[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2015，33（4）：286-290.