馬曉凡 李林

摘要[目的]篩選有效的金針菇DNA提取方法。[方法]以培養(yǎng)的金針菇菌絲體為材料，分別采用CTAB法和試劑盒法提取金針菇DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法檢測(cè)所提取DNA樣液的濃度與純度。[結(jié)果]分光光度結(jié)果及電泳鑒定表明CTAB法提取的DNA產(chǎn)量較大但雜質(zhì)多，試劑盒法提取的DNA產(chǎn)量小但雜質(zhì)少。[結(jié)論]CTAB法和試劑盒法均可用于金針菇DNA的提取，如后續(xù)試驗(yàn)對(duì)提取的DNA純度沒有特別要求，可用CTAB法替代試劑盒法。

關(guān)鍵詞 金針菇；DNA提??；CTAB法；試劑盒法

中圖分類號(hào) S646.1+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）02-0158-03

Abstract[Objective] To select the effective DNA extraction method for Flammulina velutipes.[Method] CTAB method and reagent kit method were used for extracting DNA separately by using F.velutipes mycelium as materials.The concentration and purity of DNA samples were detected by agarose gel electrophoresis method and spectrophotometric test.[Result] Compared to CTAB method，the purity of DNA extracted by reagent kit method was better，while the yield was smaller.[Conclusion] Both methods can be used for DNA extraction of F.velutipes，and if there is no strict demand for the purity of followup experiments，the reagent kit method can be replaced by CTAB method.

Key words Flammulina velutipes；DNA extraction；CTAB method；Reagent kit method

食用菌作為21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，其市場(chǎng)前景廣闊。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，有關(guān)食用菌的基礎(chǔ)研究已深入到分子水平，從各種食用菌中提取高質(zhì)量的DNA是其分子生物學(xué)研究的前提和關(guān)鍵[1-2]。目前以草菇、平菇、香菇等食用菌為材料的分子生物學(xué)研究較多，且DNA提取已有一些成功的報(bào)道[3-5]，但作為世界上產(chǎn)量居第6位的食用真菌金針菇在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域還有很多工作要做。DNA提取是獲取高產(chǎn)、優(yōu)良菌種的基礎(chǔ)，提取的DNA純度和產(chǎn)量對(duì)后續(xù)研究影響較大，為了更好地開展下游研究，有必要對(duì)金針菇DNA的提取方法進(jìn)行篩選和優(yōu)化。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用CTAB法及試劑盒法提取真菌DNA獲得了較好的結(jié)果[6-8]。該研究通過對(duì)比不同提取方法所得DNA的產(chǎn)量、純度，探尋有效提取金針菇DNA的方法，為其相關(guān)分子生物學(xué)研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源。

實(shí)驗(yàn)室收集到的金針菇種質(zhì)資源，有蔬支（SZ）、康盛（KS）、雪榕（XR）和九道菇（JD）4個(gè)品種。試驗(yàn)采用菌絲體作為材料提取DNA，菌絲體的培養(yǎng)方法是先將金針菇菌絲體斜面培養(yǎng)活化，之后轉(zhuǎn)移到PDA平板上培養(yǎng)到菌絲體鋪滿培養(yǎng)基表面，材料處理采用液氮研磨法。

1.1.2 主要試劑。

CTAB抽提緩沖液、氯仿、氯仿∶異戊醇（24∶1）、苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、異丙醇、0.5×TE緩沖液、75%乙醇、5 mol/L醋酸鈉、1 mol/L TrisHCl、試劑盒、1×TE、Regular Agarose G10、I型核酸染色劑、6×Loading Buffer、DNA Maker，以上試劑購(gòu)于煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司、天津市富宇精細(xì)化工有限公司等。

1.1.3 主要儀器。

MJ250BSHII霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；Eppendorf Research plus單道可調(diào)量程移液器（上海亞亦生物科技有限公司）；Practum1241CN分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；ND2000 NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司）；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)（BioRad公司）；BioRad電泳儀（BioRad公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法。

1.2.1.1 改良的CTAB法。①將適量金針菇研磨液倒入含700 μL 抽提緩沖液的1.5 mL滅菌離心管中，使磨碎液高度約占管2/3，輕輕攪動(dòng)混勻，65 ℃水浴恒溫1 h，每隔10 min輕搖1次，30～60 min后取出；②冷卻2 min后加入氯仿∶異戊醇（24∶1）滿管，混勻后放入離心機(jī)10 000 r/min離心10 min；③移液器吸取上清液移入另1管并加600 μL異丙醇，輕輕搖動(dòng)至可見白色絮狀物后離心，棄掉廢液，倒置離心管30 s，直立后向沉淀中滴加720 μL 75%乙醇及80 μL 5 mol/L醋酸鈉，輕彈管尖使DNA塊狀物浮游，放置30 min，使其溶解；④10 000 r/min離心后向沉淀滴加800 μL 75%乙醇，將DNA再洗30 min；⑤離心后倒去廢液自然風(fēng)干，加入50 μL 0.5×TE緩沖液（含RNase），置于37 ℃恒溫箱約15 h[9-11]。

1.2.1.2 試劑盒法。嚴(yán)格按照植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP305-08]的使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的效果，進(jìn)行改進(jìn)。具體改進(jìn)方法為將第2步中加入700 μL氯仿，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min改為加入600 μL氯仿，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min；取750 μL上清，加750 μL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）充分振蕩，12 000 r/min離心10 min；取650 μL上清，加650 μL氯仿∶異戊醇（24∶1）充分振蕩，12 000 r/min離心10 min。

1.2.2 DNA濃度和純度檢測(cè)方法。

1.2.2.1 濃度檢測(cè)方法。 5 μL DNA提取液加入1 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液吸打混勻后，加至1%瓊脂糖凝膠中，110 V電壓電泳30 min后取出，在凝膠成像儀上觀察并拍照記錄。

1.2.2.2 純度檢測(cè)方法。 取1～2 μL DNA提取液，以TE緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)各個(gè)樣品在260、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算其比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸光度比較 核酸、蛋白質(zhì)分別在260、280 nm處有紫外線最大吸收峰，純凈DNA的A260/A280比值應(yīng)介于1.8～2.0（>2.0表明有RNA污染，<1.8表明有蛋白質(zhì)污染）。分別用CTAB法與試劑盒法提取金針菇DNA，采用分光光度法檢測(cè)提取物純度，檢測(cè)結(jié)果如表1、2所示。

由表1可知，CTAB法所提取的4個(gè)品種，每品種分設(shè)4組，4個(gè)品種金針菇A260/A280的平均值分別為SZ 2.12、XR 2.14、KS 2.23、JD 3.40，排除不同品種金針菇會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的猜測(cè)，表明CTAB法可有效提取金針菇DNA，但其均值大于2.0，表明雜質(zhì)較多并有RNA污染。由表2可知，試劑盒法所提取DNA濃度較低，產(chǎn)量少，但其A260/A280穩(wěn)定于1.8～2.0，表明試劑盒法所提取DNA純度更高。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳圖比較

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)2種方法提取DNA的濃度結(jié)果如圖1、2所示。由圖1可知，16個(gè)點(diǎn)樣中有15個(gè)均為有效提取，且產(chǎn)量較大，雖在提取DNA前已加入RNase，但在瓊脂糖凝膠最前端有明顯亮帶，可能是未消化DNA、雜蛋白在點(diǎn)樣孔處有殘留，這些物質(zhì)與DNA結(jié)合形成復(fù)合物，使DNA無(wú)法離開點(diǎn)樣孔，部分條帶有少許彌散，說(shuō)明DNA存在降解。由圖2可知，試劑盒法所提取的DNA產(chǎn)量較少，但雜質(zhì)少，純度更高。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)運(yùn)用CTAB法與試劑盒法這2種方法提取金針菇DNA，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

在提取方法上，CTAB溶解細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合，Tris-HCl（pH 8.0）提供緩沖環(huán)境防止核酸被破壞。該法既能裂解細(xì)胞，又能有效沉淀多糖，過程中多次使用氯仿可使蛋白質(zhì)與核酸分離，75%乙醇洗滌可有效去除鹽離子，達(dá)到純化DNA的目的，但過程繁瑣，用時(shí)較長(zhǎng)，酚、氯仿等試劑有揮發(fā)毒性，長(zhǎng)期使用危害操作員健康，且重復(fù)使用離心管，易造成交叉污染。試劑盒法將硅膠膜固定在離心管中，用離心力讓液體通過硅膠膜，核酸則留在膜上，經(jīng)過洗滌、洗脫后得到核酸。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，缺點(diǎn)是反復(fù)離心易損失游離的DNA。

液氮研磨是機(jī)械破壁法，研磨條件劇烈易造成DNA斷裂、降解或小片段未能隨大片段基因組DNA一起離心沉淀而出現(xiàn)條帶拖尾現(xiàn)象，且沉淀時(shí)間不完全，洗滌時(shí)DNA丟失。

CTAB法提取的DNA產(chǎn)量較大但雜質(zhì)多，試劑盒法提取的DNA產(chǎn)量小但雜質(zhì)少，針對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析2種試驗(yàn)方法優(yōu)缺點(diǎn)，可將兩者結(jié)合，即在CTAB提取之后用試劑盒進(jìn)行純化，并在后續(xù)試驗(yàn)中用TE溶解DNA。

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