舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點分析

卞光明，王娜泠，胡則輝，王躍斌，胡成碩，柴學軍

（浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點分析

卞光明，王娜泠，胡則輝，王躍斌，胡成碩，柴學軍

（浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

為探討舟山帶魚種質(zhì)狀況，本研究利用直接測序法對舟山帶魚線粒體COI基因進行SNP挖掘分析，獲得長度一致的985 bp基因片段，檢測到22個SNP位點，對SNP位點在樣品中分布情況分析，發(fā)現(xiàn)部分SNP位點分布情況類似甚至完全相同，推測基于線粒體COI基因片段不同位點突變可能存在關(guān)聯(lián)性。

帶魚；線粒體COI基因；SNP；關(guān)聯(lián)性

舟山帶魚Trichiurus lepturus是舟山漁場最重要的海洋捕撈經(jīng)濟魚類，是全國首批海鮮類地理標志證明商標海鮮，其眼睛呈黑色、骨小體肥、背脊無凸骨、鱗片易脫落、肉質(zhì)鮮而不腥，與其他帶魚相比，具有DHA成分、無大骨粒異物感，被稱為“世界上最好吃的帶魚”[1]。由于舟山帶魚捕撈強度過度、人工繁育技術(shù)難度較大以及生存環(huán)境變化，舟山漁場甚至出現(xiàn)無帶魚可撈現(xiàn)象，隨著休漁、種質(zhì)資源保護區(qū)、產(chǎn)出控制等措施實施，帶魚資源狀況雖有所好轉(zhuǎn)，但群體小型化、年齡結(jié)構(gòu)失衡、產(chǎn)卵期延長以及單位漁獲量下降等現(xiàn)象仍較為嚴峻[2]。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）嚴格遵守母系遺傳、分子結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定，具有可溯源性等，常應(yīng)用于進化生物學及群體遺傳學研究。細胞色素C氧化酶I亞基（cytochrome c oxidase subunit I,COI）攜帶的遺傳信息量大、進化速率適中、中間解析能力強，已普遍應(yīng)用于銀鯧Pampus argenteus[3]、黃姑魚屬Nibea[4]、四指馬鲅屬 Eleutheronoma[5]、太湖新銀魚 Neosalanx taihuensis[6]、脊尾白蝦 Exopalaemon carinicauda[7]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[8]、大眼蟹屬Macrophthalmus[9]、紫貽貝Mytilus galloprovincialis[10]以及厚殼貽貝Mytilus coruscus[11]等水生動物種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子進化及系統(tǒng)發(fā)育。SNP分布廣、覆蓋率高、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性豐富，直接測序法操作簡單、技術(shù)成熟、無需通過多個位點構(gòu)建遺傳圖譜，特別適合魚類等較小目的基因片段研究[12]。目前所報道的研究主要采用 16S rRNA[13]、18S rDNA[14]、D-loop[15-16]、COI[17]、SSR[18]分析不同海域帶魚群體，未見具體分析舟山帶魚線粒體COI基因SNP位點特性研究。本研究利用直接測序法對舟山帶魚的線粒體COI基因區(qū)域進行SNP位點挖掘和分析，以期為舟山帶魚遺傳學研究、種質(zhì)資源的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用60個帶魚樣品由雙拖船取自舟山朱家尖附近海域（122°47′E，29°97′N），取樣時間為2016年4月中旬，現(xiàn)場取樣并剪下背部肌肉于95%酒精中保存，帶回實驗室置于-20℃保存待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

按照天根海洋動物基因組提取試劑盒操作說明提取總基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測其質(zhì)量與濃度，稀釋為50 ng/μL，-20℃保存待用。

1.2.2 引物設(shè)計

從GenBank中下載帶魚線粒體全基因組序列[19]，用Oligo7軟件[20]設(shè)計引物擴增目的片段，目的片段大小在1 200 bp左右，引物序列為COI-F：CTTATCCGAGCAGAACTAAG，COI-R：ACGGCTCCTATTGATAGAAC，退火溫度55℃左右，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及測序

PCR 反應(yīng)總體系為 50 μL，模板 DNA 100 ng，0.5 μL 上、下游引物（10 μmol/L），1 μL dNTP（10 mmol/μL），5 μL 10×Buffer（含Mg2+），0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），去離子水補充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用ContigExpress Project[21]對測序結(jié)果進行拼接，再使用BioEdit[22]對所得序列進行比對篩選，利用Chromas 2.4.1分析序列峰圖，以測序波峰整齊，沒有雜峰，突變堿基位點樣品數(shù)不少于2個的位點記作有效突變位點，以排除測序機器誤讀或錯讀產(chǎn)生的變異位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖如圖1所示，Marker為2 000 bp，從下至上依次為（100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp），從電泳圖上可觀察到，產(chǎn)物片段的大小與設(shè)計的目的片段的長度一致（1 200 bp），且條帶明亮、清晰，沒有雜帶，滿足直接測序的要求。

2.2 SNP位點峰圖

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis results of part PCR product

本文對三個突變頻率大于25%的SNP位點進行峰圖分析（23位點、500位點、773位點），位點具體突變形式如圖2～4所示，三個SNP位點波峰整齊、無雜峰。

SNP23突變形式：C/T轉(zhuǎn)換

SNP500突變形式：T/C轉(zhuǎn)換

SNP 773突變形式：G/A轉(zhuǎn)換

圖2 COI基因23位點突變形式Fig.2 Mutation forms of COI gene at 23rdlocus

圖3 COI基因500位點突變形式Fig.3 Mutation forms of COI gene at 500thlocus

圖4 COI基因733位點突變形式Fig.4 Mutation forms of COI gene at 733rdlocus

2.3 SNP位點統(tǒng)計分析

使用BioEdit軟件對測序序列比對分析，刪除兩端不穩(wěn)定序列，獲得985 bp基因片段，共檢測到22個變異位點，檢測到SNP位點具體情況見表1，773位點、23位點、500位點以及953位點突變率較高，分別為43.67%、25.00%、25.00% 以及23.33%。

表1 COI基因序列部分區(qū)域SNP位點Tab.1 SNPs identified in COI gene subregio

表2為SNP位點在60個帶魚樣品中的具體分布情況，從表中可以發(fā)現(xiàn)，815位點、857位點、968位點以及983位點發(fā)生突變可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，位點突變率均為18.33%，在11個樣品中均檢測到且分布情況完全一致；位點119、位點404以及位點977的位點突變率為6.67%；位點353與位點413的位點突變率為6.67%，在樣品中的分布情況也呈現(xiàn)一致，雖然突變數(shù)量較少（位點突變率僅為6.67%），但不排除相關(guān)位點之間的突變存在關(guān)聯(lián)性。除此以外，440位點、500位點以及953位點在樣品中的分布情況相似度也較高。

表2 SNP位點在樣品中的分布情況Tab.2 The distribution of SNP locus in samples

續(xù)表

3 討論

本文采用直接測序法對帶魚COI基因進行測序，有效避免傳統(tǒng)基因克隆方法對變異位點分型產(chǎn)生誤讀、錯讀等影響。在獲得的985 bp片段中檢測到22個變異位點，變異率為0.021 3，與帶魚其他相關(guān)研究結(jié)果相近[17]。根據(jù)Chromas 2.4.1分析序列峰圖所示，變異位點峰圖清晰、無雜帶，能夠?qū)NP位點進行精準的統(tǒng)計。對線粒體COI基因片段SNP位點在60個舟山帶魚樣品中的分布情況統(tǒng)計的過程中，發(fā)現(xiàn)一些SNP位點變異頻率以及分布情況存在相似性甚至完全相同，關(guān)于不同位點變異是否存在關(guān)聯(lián)性，還有待于進一步研究。

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[2]浙江省海洋水產(chǎn)研究所資源室.2015年上半年浙江海洋漁業(yè)資源動態(tài)評析[DB/OL].(2015-09-11)[2016-08-15].http://www.zjhys.cn/news/hydt/20159/1111331020951901.html.

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Analysis on Mitochondrial COI Gene SNP Loci of Trichiurus lepturus from Zhoushan Sea Area

BIAN Guang-ming,WANG Na-ling,HU Ze-hui,et al
(Marine and Fisheries Institute of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Marine Fisheries Institute,Zhoushan 316021,China)

To investigate the germplasm resources of Trichiurus lepturus collected from Zhoushan coastal sea area,SNP loci and analysis based on mtDNA COI gene were carried out using direct sequencing technique.The fragments with the length of 985 bp were obtained,detecting 22 SNP locus.According to the similar or even identical distribution of SNP locus in samples,there may be a correlation between mutations of mtDNA COI gene fragments at different sites.

Trichiurus lepturus;mitochondrial COI gene;SNP;correlation

Q953+.3

：A

2016-11-10

浙江省科技廳合作與轉(zhuǎn)化項目（2013F50003）；舟山市公益項目（2015C31013）

卞光明（1992-），男，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：種質(zhì)與種苗工程.E-mail:mingbg@163.com

柴學軍（1972-），男，教授級高工，研究方向：魚類繁育與海洋生物技術(shù).E-mail:chaixj6530@sohu.com

1008－830X(2017)01－0019－06