劉 燁 馬曉燕

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

·研究報(bào)告·

腎衰飲對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠ATF6/CHOP通路的作用研究*

劉 燁 馬曉燕△

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

目的 觀察腎衰飲對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎臟ATF6/CHOP通路的影響，探析腎衰飲延緩慢性腎功能衰竭的作用機(jī)制。方法 52只SD大鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)抽取10只為正常組，其他大鼠采用腺嘌呤灌胃法模型3周。造模成功后隨機(jī)分為模型組、腎衰飲組和尿毒清組。腎衰飲組和尿毒清組分別給予腎衰飲煎劑和尿毒清顆粒連續(xù)灌胃4周。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐、尿素氮含量，HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化，Western Blot技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟ATF6、CHOP、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組比較，模型組Scr、BUN水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組和尿毒清組大鼠Scr、BUN水平均顯著降低（P＜0.01）。HE染色提示：腎衰飲及尿毒清能夠改善模型組大鼠腎臟病理學(xué)改變。Western Blot結(jié)果提示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組大鼠ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論 腎衰飲可能通過影響ATF6/CHOP通路，減少腎組織細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損腎臟功能。

慢性腎功能衰竭 腎衰飲 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 ATF6 CHOP 凋亡

【Key words】Chronic renal insufficiency；Shenshuaiyin Decoction；Endoplasmic reticulum stress；ATF6；CHOP；Apoptosis

隨著我國(guó)人口平均年齡的增加及老齡化的到來，慢性腎功能衰竭（CRF）嚴(yán)重威脅著人們健康和生活質(zhì)量。CRF是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段。對(duì)于患者而言，本病治療將進(jìn)行腎移植或終生接受透析，價(jià)格昂貴，且不適用于疾病的早、中期階段。因此，積極防治慢性腎臟疾病，延緩腎功能衰竭進(jìn)程具有重要意義。

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，炎癥和凋亡是其重要的病理變化［1-2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，腎臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，具有發(fā)生ERS的條件和基礎(chǔ)。對(duì)ERS進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)，對(duì)于挽救殘存的腎臟細(xì)胞，保護(hù)腎臟功能具有重要影響。

課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，腎衰飲能夠減輕腎組織損傷，改善腎功能［3-4］，但對(duì)于其作用機(jī)制的探究尚不全面。本實(shí)驗(yàn)以腎衰大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以ERS為切入點(diǎn)，探究腎衰飲對(duì)腎衰竭大鼠腎臟功能的保護(hù)作用，為闡明腎衰飲防治腎衰的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD雄性大鼠52只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)買于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食與飲水。溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試藥與儀器 腺嘌呤25 g/瓶（Amresco，美國(guó)）；尿毒清5 g/袋（廣州康臣藥業(yè)有限公司）；腎衰飲購(gòu)自遼寧省中醫(yī)院中藥局（組成：黃芪40 g，太子參20 g，水紅花子15 g，夏枯草20 g，砂仁10 g，白術(shù)15 g，菟絲子15 g，土茯苓30 g，白茅根30 g，藿香15 g，大黃10 g，法半夏10 g，丹參15 g，水蛭5 g，莪術(shù)10 g，鱉甲20 g。遼寧省中醫(yī)院中藥局）；肌酐（Scr）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：C013-2。南京建成生物工程研究所）；尿素氮（BUN）測(cè)定試劑盒 （貨號(hào)：C011-2，南京建成生物工程研究所）；ATF6抗體（貨號(hào)：bs1287R。中國(guó)博奧森）、CHOP抗體（貨號(hào)：2958。美國(guó)CST）、Bcl-2抗體 （貨號(hào)：bs-20163R。中國(guó)博奧森）、Bax（貨號(hào)：bs-0127M。中國(guó)博奧森）、Caspase-3抗體 （貨號(hào)：9662。美國(guó)CST）；β-actin（貨號(hào)：J2114。美國(guó)santa）羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記IgG（貨號(hào)：CW0103。中國(guó)康維）、羊抗小鼠過氧化物酶標(biāo)記IgG（貨號(hào)：CW0102。中國(guó)康維）。儀器設(shè)備：TriStar2 LB 942型多功能酶標(biāo)儀（伯托公司，德國(guó)），組織破碎機(jī)（德國(guó)，IKA），低速冷凍離心機(jī)（Thermo，美國(guó)），干式恒溫器酶標(biāo)儀Multiskan FC型（Thermo，美國(guó)），垂直板電泳裝置（Bio-Rad，美國(guó)），Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)?。˙io-Rad，美國(guó)）。

1.3 分組與造模 按體質(zhì)量分層隨機(jī)抽取10只為正常組，剩余42只大鼠進(jìn)行造模：腺嘌呤懸濁液200 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃3周［5］［正常組予8 mL/（kg·d）0.9%氯化鈉溶液灌胃］。第4周時(shí)模型組隨機(jī)抓取6只大鼠，正常組取2只進(jìn)行腎功能檢測(cè)及腎臟病理觀察。造模成功后，將所有造模大鼠隨機(jī)分為模型組、腎衰飲組與尿毒清組，各12只。尿毒清組予尿毒清顆粒2.25 g/kg灌胃治療；腎衰飲組大鼠給予毫升藥液含生藥量為3.36 g的腎衰飲煎劑33.3 g/kg灌胃治療；模型組和正常組予0.9%氯化鈉溶液8 mL/kg灌胃。連續(xù)給藥4周后，所有大鼠取材，進(jìn)行各指標(biāo)監(jiān)測(cè)。造模及治療期間大鼠死亡情況：模型組3只，尿毒清組2只，腎衰飲組2只。死亡原因考慮為灌胃手法不當(dāng)，灌胃液體誤入氣管所致。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 腎功能檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清Scr及BUN含量比較。形態(tài)學(xué)檢測(cè)腎組織逐步進(jìn)行4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、厚度為4～5 μm切片。切片進(jìn)行HE染色，最后用光學(xué)顯微鏡觀察各組腎臟組織的病理變化并拍照。Western blot檢測(cè)，稱量0.1 g腎臟組織，加1 mL裂解液研磨提，勻漿液1200 r/min 10 min，4℃離心取上清。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白100℃變性5 min，每孔60 μg蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗孵育 ATF6（1∶300）、CHOP（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、β-actin（1∶800）室溫孵育1 h后4℃過夜，次日二抗孵育1 h后加ECL發(fā)光液曝光，目的蛋白分別與β-actin條帶的光密度比值后，再各組比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以 （±s）表示，采用單因素方差分析結(jié)合Turkeys test比較各組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清Scr、BUN水平的比較 見表1。與正常組比較，模型組Scr、BUN含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組及尿毒清組Scr、BUN含量顯著降低（P＜0.01），且腎衰飲組下調(diào)更明顯。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 肌酐（μmol/L） 尿素氮（mmol/L）正常組 8 40.75±7.00 3.82±1.4模型組 9 84.15±10.93**10.00±1.69**腎衰飲組 10 54.85±4.74△△7.17±1.23△△尿毒清組 10 59.03±4.75△△8.02±1.17△△

2.2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化 見圖1。正常組大鼠腎臟形態(tài)正常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常組相比，模型組腎臟皮質(zhì)，腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)大小異常，血管球萎縮腎球囊變大比例失調(diào)，腎小管變性壞死、萎縮，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腎衰飲組與尿毒清組對(duì)模型均有一定的改善作用，尿毒清組腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)大小接近正常，血管球充盈，腎球囊腔大小比例基本正常，腎小管的管壁薄均勻管腔大小正常，腫脹有所減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎衰飲組腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)大小接近正常，血管球充盈，腎球囊腔比例基本正常，腎小管的管壁薄厚管腔大小基本正常，腫脹基本消失，偶見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠腎臟組織（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠腎臟組織ATF6/CHOP通路蛋白表達(dá)水平比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠腎臟ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高 （P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組大鼠ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）；尿毒清組ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低 （P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 大鼠腎臟ATF6/CHOP通路蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 大鼠腎臟ATF6/CHOP通路蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別 n ATF6CHOP Bcl-2/Bax Caspase-3正常組 8 0.502±0.033模型組 9 0.626±0.016**腎衰飲組 10 0.519±0.049△△0.663±0.073 1.112±0.069**0.716±0.084△△0.00224±0.00018 0.543±0.015 0.00079±0.00008**0.899±0.086**0.00166±0.00025△△0.763±0.019△尿毒清組 10 0.544±0.028△△0.496±0.033△△0.00242±0.00041△△0.656±0.059△△

3 討 論

CRF是各種慢性腎臟疾病腎功能惡化的結(jié)果，嚴(yán)重影響著人民的生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)對(duì)于CRF早中期的治療有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。筆者以中醫(yī)理論為依據(jù)，對(duì)CRF發(fā)病機(jī)制深入研究，認(rèn)為內(nèi)生之毒是導(dǎo)致CRF的關(guān)鍵［6］，并提出以“補(bǔ)腎健脾，祛濕化濁、滌痰活血、清熱解毒”的治療原則［7］，自擬經(jīng)驗(yàn)方腎衰飲，攻補(bǔ)兼施，集抗毒、解毒、排毒三法于一方，多途徑祛毒外出，同時(shí)，祛邪不忘扶正，重視調(diào)理脾胃升降［8］。一些前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，腎衰飲對(duì)減少蛋白尿，抑制腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展具有很好的效果。

本實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎衰飲能夠降低CRF大鼠血清中Scr和BUN水平，改善模型組大鼠腎臟組織的病理狀態(tài)，對(duì)受損的腎臟組織功能起到了保護(hù)作用。Western Blot結(jié)果提示腎衰飲對(duì)CRF大鼠腎臟的保護(hù)作用可能是通過減輕腎組織ERS，減少腎臟細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

腎小管上皮細(xì)胞過度凋亡可能是腎功能惡化的重要機(jī)制之一［9］。ERS是近年來發(fā)現(xiàn)的一種啟動(dòng)凋亡的新途徑，ERS是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂時(shí)出現(xiàn)的一種亞細(xì)胞病理狀態(tài)，持續(xù)過度的ERS會(huì)引起細(xì)胞的凋亡［10］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是新生蛋白折疊的地方，只有正常折疊的蛋白才能夠運(yùn)送至高爾基體，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變，出現(xiàn)炎癥、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，未折疊蛋白就會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚并引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），細(xì)胞啟動(dòng)UPR恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)發(fā)生ERS的細(xì)胞［11］。ERS發(fā)生時(shí)，UPR可激活3種轉(zhuǎn)錄因子，ATF6是其中之一。ERS發(fā)生時(shí)，ATF6會(huì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)位到高爾基體中被激活，轉(zhuǎn)而進(jìn)入細(xì)胞核，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件結(jié)合后誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)［12］。本文研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ATF6蛋白表達(dá)顯著升高，說明CRF大鼠存在ERS，腎衰飲能夠下調(diào)模型組高表達(dá)的ATF6，說明腎衰飲可能通過該途徑減輕CRF大鼠腎臟ERS。

當(dāng)ERS持續(xù)存在時(shí)，活化的ATF6能夠誘導(dǎo)CHOP［13］。CHOP又稱生長(zhǎng)停滯及DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153［14］。在正常情況下，CHOP主要存在于細(xì)胞漿中且表達(dá)量很低［15］，而細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，ATF6可以上調(diào)CHOP表達(dá)，CHOP的主要作用是在UPR過程中通過編碼蛋白質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16］。在我們實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎臟組織中CHOP蛋白高表達(dá)，且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值降低，說明CHOP可能激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)了細(xì)胞的抗凋亡能力。與模型組相比較，腎衰飲組CHOP與Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降，Bcl-2/Bax比值升高，提示我們腎衰飲可能通過ATF6/CHOP途徑減輕ERS反應(yīng)，減少腎臟細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腎衰飲能夠延緩CRF大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)進(jìn)展，改善受損腎功能，其機(jī)制可能是通過影響ATF6/CHOP途徑實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of Shenshuaiyin Decoction on ATF6/CHOP Pathway in Kidney Tissues of Chronic Renal FailureRats

LIU Ye，MA Xiaoyan. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

Objective：To discuss the pharmacology mechanism of Shenshuaiyin Decoction delaying the kidney failure by observing the effect of Shenshuaiyin Decoction on ATF6/CHOP pathway in kidney tissues of chronic renal failure rats.Methods：From 52 SD rats，8 rats were randomly selected as the normal group.The other rats were taken as renal failure models by adenine gavage method for 3 weeks.After successful modeling，the modeled rats were randomly divided into model group，Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group.The Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group rats were given Shenshuaiyin Decoction and Niaoduqing gavage for 4 weeks.SCr and BUN were tested using the automatic biochemical analyzer.The renal pathological changes in rats of each group were observed by HE staining method.ATF6，CHOP，Bcl-2，Bax and Caspase-3 protein expression were tested with Western blot methods.Results：Compared with the normal group，the Scr and BUN level in the model group increased significantly（P＜0.01）.Compared with the model group，the Scr and BUN level in Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group decreased significantly（P＜0.01）.HE staining results showed that Shenshuaiyin Decoction and Niaoduqing could improve the renal pathological changes in rats of the model group.Western blot results showed that compared with the normal group，the expression level of ATF6，CHOP，Caspase3 increased significantly（P＜0.01）and the expression levels of Bcl-2/Bax decreased significantly（P＜0.01）in the model group.Compared with the model group，the expression level of ATF6，CHOP，Caspase-3 decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）and the expression levels of Bcl-2/Bax increased significantly（P＜0.01）in Shenshuaiyin Decoction group.Conclusion：Shenshuaiyin Decoction plays an important biological role in reducing renal tissue cell apoptosis and improving the impaired renal function via regulating ATF6/CHOP pathway of chronic renal failure rats.

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0768-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.005

2017-02-24）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81373527）；沈陽(yáng)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（F13-220-9-18）

△通信作者（電子郵箱：aaaxyma@hotmail.com）