武 鈺，閆明俞，耿文寧，李海芳，姚 軍

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830004）

棉籽油中游離棉酚脫毒評(píng)價(jià)新方法

武 鈺1，閆明俞2，耿文寧2，李海芳2，姚 軍1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830004）

由于棉籽油中游離棉酚在常溫下極易降解（30d內(nèi)降解80%以上），現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法很難反映棉籽油的脫毒情況。該文通過自制未脫毒棉籽油樣品，考察游離棉酚在棉籽油中的降解情況，確定主要游離棉酚降解產(chǎn)物并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，建立棉籽油中主要游離棉酚降解產(chǎn)物的含量測(cè)定方法。經(jīng)LC-FTICRMS質(zhì)譜儀檢測(cè)，主要游離棉酚降解產(chǎn)物m/z為573.25033，推測(cè)其分子式為C34H37O8，鑒定結(jié)構(gòu)為四甲氧基棉酚。對(duì)24批市售棉籽油樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中20批棉籽油樣品檢測(cè)到主要游離棉酚降解產(chǎn)物，含量為0.139～0.912μg/mL。通過測(cè)定棉籽油中主要游離棉酚降解產(chǎn)物反映游離棉酚的脫毒情況，證明該方法切實(shí)可行，可為新疆地區(qū)棉籽油的生產(chǎn)和監(jiān)管提供有效檢測(cè)方法。

棉籽油；游離棉酚降解產(chǎn)物；結(jié)構(gòu)鑒定；四甲氧基棉酚

0 引 言

棉籽油（cottonseed oil）是從棉花屬植物種子中提煉的食用油，主要來源為陸地棉和草棉。棉花是一種重要的生活資料，新疆作為我國(guó)重要的棉花產(chǎn)地，棉花產(chǎn)量約占全國(guó)的50%以上，副產(chǎn)物棉籽也成為當(dāng)?shù)刂匾挠土霞暗鞍罪暳腺Y源，因此新疆是我國(guó)棉籽加工的重要基地。在棉籽油生產(chǎn)加工、食用過程中，棉籽中的內(nèi)源性物質(zhì)——棉酚（gossypol）成為研究關(guān)注的重點(diǎn)，由于游離棉酚具有明確的毒副作用，并且在棉籽中含量較大，因此棉籽油生產(chǎn)工藝中非常重要的環(huán)節(jié)就是棉酚的脫毒工藝[1]。因棉酚在棉籽油中極易降解（30d內(nèi)降解80%以上），而目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了棉籽油中棉酚的檢測(cè)方法及限量，不足以反映棉籽油中棉酚脫毒情況[2-3]。本文通過自制未脫毒的棉籽油樣品，室溫放置，不同時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，建立棉酚與降解產(chǎn)物之間的量變關(guān)系。通過檢測(cè)棉籽油中降解產(chǎn)物的含量，計(jì)算棉酚的含量，從而考察棉籽油的脫毒情況，建立棉籽油中游離棉酚脫毒評(píng)價(jià)新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1220 LC二元泵高效液相色譜儀；SHIMADZU LC-6AD半制備型液相色譜儀；Bruker Daltonics SolariX 9.4 Tesla LC-FTICRMS質(zhì)譜儀；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；BS110S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；EYELA OSB-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 樣品與試藥

甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific，美國(guó)）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific，美國(guó)）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，成都市科龍化工試劑廠）；乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；本文所檢測(cè)的24批市售棉籽油樣品均來自新疆各地榨油廠。

2 樣品前處理

2.1 未脫毒棉籽油的制備

棉籽油的提取工藝主要有溶劑浸提法、溶劑超聲法，超臨界CO2萃取法等[4-7]。本文根據(jù)新疆地區(qū)棉籽油的生產(chǎn)工藝，采用正己烷浸提法提取未脫毒棉籽油。將棉籽脫殼，蒸炒，用粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，備用。稱棉籽粉末50g，置于500mL三角瓶中，倒入正己烷并將瓶口密封，料液比為1∶4，浸出溫度60℃，浸出時(shí)間為150min。過濾除渣，蒸發(fā)脫溶，即得未脫毒的棉籽油粗品。

2.2 供試品溶液的制備

稱取棉籽油樣品1g（精確至0.01g）于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，4000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜，即為供試品溶液。

2.3 采用半制備型液相色譜儀制備棉酚降解產(chǎn)物

將在室溫下放置30d的棉籽油，按上述方法制備供試品溶液。色譜柱YMC-Pack ODS-A（250mm×20 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水（70∶30，ν∶ν），流量4.0mL/min，柱溫為室溫，25～30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 235nm，進(jìn)樣量4mL。所制備的棉酚降解產(chǎn)物純度為80%，作為工作標(biāo)樣，見圖1。

圖1 降解后的棉籽油HPLC圖

3 棉酚降解產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步鑒定

3.1 LC-FTICRMS條件

采用電噴霧離子源負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍準(zhǔn)分子離子為110～1 200，噴霧電壓2 700V，毛細(xì)管溫度110℃，源溫75℃，錐孔電壓-7.5V，檢測(cè)激發(fā)電壓130V。Acclaim?120 C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流動(dòng)相為甲醇∶0.1%甲酸（90∶10，ν∶ν），流量0.2mL/min，柱溫 30℃。

3.2 分子量的測(cè)定

經(jīng)質(zhì)譜儀檢測(cè)，可知棉酚降解產(chǎn)物m/z 573.250 33，分子式為C34H37O8，結(jié)果見圖2。

圖2 棉酚降解產(chǎn)物質(zhì)譜圖

3.3 分子結(jié)構(gòu)的推測(cè)

由于棉酚的酚羥基不穩(wěn)定，在放置過程中，酚羥基中的H易發(fā)生甲基化反應(yīng)。根據(jù)棉酚降解產(chǎn)物準(zhǔn)確分子量為574.249 39，經(jīng)質(zhì)譜儀檢測(cè)降解產(chǎn)物m/z 574.25033，本試驗(yàn)所使用的質(zhì)譜儀為高分辨質(zhì)譜，測(cè)定值可精確至小數(shù)點(diǎn)后5位，由于理論分子量與測(cè)定分子量非常接近，故推測(cè)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為四甲氧基棉酚[8-10]，如圖3所示。

4 棉籽油中游離棉酚與降解產(chǎn)物之間的量變關(guān)系

將5份未脫毒的棉籽油粗品放置在25℃室溫下，不避光保存，作為平行樣。每份棉籽油粗品均分別在 0，5，10，20，30d 取樣，放置于-21℃冰箱中，按 2.2 制備供試品溶液，按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著放置時(shí)間的增加，棉酚峰面積逐漸減小的同時(shí)，降解產(chǎn)物峰面積逐漸增加，結(jié)果見圖4。以降解產(chǎn)物峰面積為X軸，棉酚峰面積為Y軸作圖，線性方程 Y=-3.006 743 95X+2 058 258 982，r=0.990 0。結(jié)合外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算游離棉酚與降解產(chǎn)物之間的量變關(guān)系為Cs=3.0Ci，Cs為游離棉酚濃度，Ci為降解產(chǎn)物濃度。

圖3 四甲氧基棉酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖4 不同放置時(shí)間棉籽油中游離棉酚降解情況HPLC圖

5 棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物HPLC檢測(cè)方法的建立

5.1 色譜條件

色譜柱Inertsil?ODS-3（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇∶2%磷酸（85∶15，ν∶ν），流量 1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。

5.2 方法學(xué)考察

5.2.1 線性關(guān)系考察

精密稱取已制備的棉酚降解產(chǎn)物工作標(biāo)樣10mg，用乙醇定容至250mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的棉酚降解產(chǎn)物儲(chǔ)備液，以無水乙醇稀釋至1 μg/mL的降解產(chǎn)物溶液。精密吸取該溶液各 1，2，4，6，8，10 mL 置于 10 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。棉酚降解產(chǎn)物在0.1～1μg/mL范圍內(nèi)線性良好。得線性回歸方程為：Y=110 520 637.5X-582 707.5，r=0.9995。

5.2.2 精密度試驗(yàn)

同一份棉酚降解產(chǎn)物溶液，按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。測(cè)得棉酚降解產(chǎn)物日內(nèi)峰面積R SD為0.22%。

5.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批棉籽油樣品5份，各1 g（精確至0.01g）于離心試管中，按2.2制備供試品溶液。按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。測(cè)得棉酚降解產(chǎn)物峰面積R SD為1.80%。

5.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，于 0，2，4，8，12，24h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。測(cè)得棉酚降解產(chǎn)物峰面積R SD為0.75%。

5.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的棉籽油樣品9份，各0.5g，每3份為一組作為平行樣，分別加入質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的棉酚降解產(chǎn)物儲(chǔ)備液各3.00，3.75，4.50mL于離心管中，按上述方法制備供試品溶液。按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，棉酚降解產(chǎn)物的平均回收率為93.2%，R SD為3.93%（結(jié)果見表1）。

5.3 市售棉籽油中棉酚降解產(chǎn)物含量的測(cè)定

將市售的24批棉籽油樣品按上述方法制備供試品溶液，按5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)，24批市售棉籽油均未檢測(cè)到棉酚，其中有20批市售棉籽油樣品檢測(cè)到降解產(chǎn)物，為0.139～0.912μg/mL，相當(dāng)于棉籽油中棉酚質(zhì)量濃度為0.417～2.736μg/mL，結(jié)果見表2。將市售棉籽油樣品與未脫毒棉籽油樣品HPLC圖對(duì)比，結(jié)果見圖5。

表1 游離棉酚降解產(chǎn)物回收率試驗(yàn)

表2 24批市售棉籽油樣品中棉酚降解產(chǎn)物含量

圖5 市售棉籽油與未脫毒棉籽油HPLC圖

6 結(jié)束語

由于棉酚在棉籽油中極易降解，在棉籽油出廠和銷售過程中，棉酚很可能已經(jīng)降解完全。對(duì)24批市售棉籽油樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)到棉酚。為了還原棉酚在棉籽油中的降解過程，本試驗(yàn)在棉籽油生產(chǎn)過程中未進(jìn)行脫毒處理，得到的棉籽油粗品中棉酚含量較高。通過對(duì)不同放置時(shí)間的未脫毒棉籽油進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著放置時(shí)間的增加，棉酚峰面積逐漸減小的同時(shí)，降解產(chǎn)物峰面積逐漸增加，且兩者之間呈現(xiàn)一定的量變關(guān)系。

本試驗(yàn)采用高分辨質(zhì)譜對(duì)棉酚降解產(chǎn)物的分子量進(jìn)行測(cè)定，并推測(cè)其主要結(jié)構(gòu)可能為四甲氧基棉酚。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)，并通過紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振的檢測(cè)，最終確定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

本文通過游離棉酚與降解產(chǎn)物之間的量變關(guān)系，建立了棉籽油中棉酚脫毒評(píng)價(jià)新方法，從而提高棉籽油的安全質(zhì)量。

[1]欒姝，孟磊，孫蓮，等.高效液相色譜法測(cè)定棉籽仁中棉酚的含量[J].食品科學(xué)，2010，31（4）：198-200.

[2]何曉文，李新霞，姚軍，等.柱前手性衍生化-高效液相色譜法測(cè)定棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量[J].食品科學(xué)，2013，34（12）:125-128.

[3]周晨忱，王晶，姚軍，等.HPLC法考察棉籽油放置過程中游離棉酚穩(wěn)定性[J].食品科技，2014，39（9）：311-314.

[4]李煥榮，武運(yùn)，張鳳，等.棉籽油提取工藝的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（3）：51-53.

[5]張飛，薛曉金.異丙醇浸出棉籽油的研究[J].中國(guó)油脂，2008，33（7）：13-16.

[6]史慶龍，葛發(fā)歡，楊得坡，等.棉籽油的超臨界CO2流體萃取及其 GC-MS 分析[J].中藥材，2001，24（12）：872-874.

[7]蔣成俊，莫清.棉籽油的超聲提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（12）：7420-7422.

[8]李玲，劉玉秀，汪清民.棉酚的結(jié)構(gòu)衍生及構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)科技論文，2015，10（12）：1352-1357.

[9]MORRIS R C，ADAMS R.The structure of gossypol III Gossypol Ethers[J].Journal of the American Chemical Society，1937，59（9）：1731-1735.

[10]ADAMS R，GEISSMAN T A.Structure of gossypol VII gossypol dimethyl ether[J].Journal of the American Chemical Society，1938，60（9）：2163-2166.

（編輯：莫婕）

A new detoxification evaluation method of free gossypol in cottonseed oil

WU Yu1，YAN Mingyu2，GENG Wenning2，LI Haifang2，YAO Jun1
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Food and Drug Administration，Urumqi 830004，China）

Through current national standards the detoxication of cottonseed oil is hard to be detected because the free gossypol in cottonseed oil can easily be degraded at room temperature with a speed of over 80% of its contents within 30 days.This test examines the quantitative relationship between free gossypol and its degradation products by making undegraded cottonseed oilsamples，identificates chemicalstructure ofmain gossypoldegradation products and also establishes a new method to evaluate free gossypol detoxification in cottonseed oil.According to the LC-FTICRMS，the main degradation products of free gossypol m/z was 573.250 33，the molecular formula is C34H37O8，its structure identified as tetramethoxyl gossypol.24 batches of cotton seed oil samples were tested，and the main free gossypol degradation products were detected in 20 batches of cottonseed oil，the content of which was from 0.139 to 0.912 μg/mL.By testing the gossypol detoxification of the degradation products in cottonseed oil，the method is proven feasible as a new method of free gossypol detoxification evaluation in cottonseed oil.

cottonseed oil；free gossypol degradation products；structure identification；tetramethoxyl gossypol

A

1674-5124（2017）04-0052-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.012

2016-10-20；

2016-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31160322，31460417）

武 鈺（1990-），女，吉林梅河口市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

姚 軍（1973-），男，湖北襄陽(yáng)市人，副教授，博士，主要從事藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。李海芳（1977-），女，甘肅張掖市人，副主任藥師，主要從事藥理毒理研究。