周 瑩， 韓玉龍， 駱 劍， 王 茜， 陳國華

(南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?70228)

鞍帶石斑魚、棕點石斑魚及其雜交子代DNA甲基化的MSAP分析

周 瑩， 韓玉龍， 駱 劍， 王 茜， 陳國華

(南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 海口570228)

為了探究海洋魚類雜交優(yōu)勢的產(chǎn)生機制，以鞍帶石斑魚、棕點石斑魚及其雜交子一代石斑魚為研究對象，采用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)對三個群體的基因組DNA的胞嘧啶甲基化修飾水平進(jìn)行了研究.實驗結(jié)果顯示，棕點石斑魚、鞍帶石斑魚、雜交子一代石斑魚的基因組DNA的總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%，在石斑魚親本的基因組中，其DNA的甲基化程度較高，而在雜交子代中，其DNA的甲基化程度較低.三個群體的DNA全甲基化率分別為31.66%，39.71%，40.00%，半甲基化率分別為25.52%，23.44%，14.76%，雜交子代的半甲基化率顯著低于親本的半甲基化率.研究表明，鞍帶石斑魚與棕點石斑魚的雜交子代在基因組層面上和雙親相比發(fā)生了較大的甲基化水平的調(diào)整，于不同位點，DNA甲基化的增強或減弱對石斑魚雜種優(yōu)勢可能會產(chǎn)生影響.

石斑魚； DNA甲基化； 甲基化敏感擴增多態(tài)性； 雜種優(yōu)勢

石斑魚隸屬鱸形目、鮨科、石斑魚屬，屬暖水性魚類，主要分布在熱帶及亞熱帶海區(qū)，屬世界名貴海水魚類，其在我國南部沿海地區(qū)均有廣泛養(yǎng)殖，具有較高的經(jīng)濟效益.但近年來，由于過度捕撈和其棲息地遭到破壞，從而造成野生石斑魚的種群規(guī)?？s小和種質(zhì)資源退化，致使石斑魚優(yōu)良品種缺乏，這已成為制約養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸因素[1-2].采用遠(yuǎn)緣雜交的方法來獲得具有雜種優(yōu)勢的子一代是快速有效的品種改良方式.石斑魚種類眾多，由于揭示石斑魚雜種優(yōu)勢的主要作用機制是開展雜交育種工作的重要基礎(chǔ)，因此選擇合適的親本雜交組合就成為培育石斑魚優(yōu)良雜種的關(guān)鍵.

雜種優(yōu)勢的機制包括“顯性說”、“超顯性說”和“上位效應(yīng)說”等，它們均在一定程度上揭示了雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的機制，這些機制主要源于親本之間的基因型差異.Romagnoli等[3]的研究證實了玉米雜種根尖中的基因差異表達(dá)與雜種優(yōu)勢的關(guān)聯(lián)，不僅如此，越來越多的研究亦表明了基因表達(dá)差異對于雜種優(yōu)勢的作用[4-5].DNA甲基化作為主要的基因表觀修飾方式之一，其程度的改變已被證實會對高等動植物的雜種優(yōu)勢產(chǎn)生顯著的作用[6-7].

棕點石斑魚(E.fuscoguttatus)俗稱老虎斑，其生長速度較慢，飼養(yǎng)時間長，但是抗病力強；鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)又稱龍躉石斑魚，其肉質(zhì)鮮美，體型較大，生長速度快.以棕點石斑魚為母本和以鞍帶石斑魚為父本進(jìn)行雜交所得到的雜種子一代具有“虎斑頭、龍膽尾”的外型，其集母本抗病力強和父本生長速度快等優(yōu)點于一身，適應(yīng)環(huán)境能力強，體長增長比母本棕點石斑魚快35.9%，體重增長快114.5%，顯示出較強的雜種優(yōu)勢[8-9].本實驗以該雜交組合為研究對象，采用MSAP技術(shù)來分析鞍帶石斑魚、棕點石斑魚和其雜交子一代間DNA甲基化水平的差異，研究了DNA甲基化與雜種優(yōu)勢的關(guān)系，旨在揭示石斑魚雜種優(yōu)勢的機理和為雜交育種提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材 料 實驗材料取自海南陵水石斑魚養(yǎng)殖基地，選取了棕點石斑魚♀×鞍帶石斑魚♂的雜交子代幼魚群體，以母本棕點石斑魚群體自交的子代幼魚群體和父本鞍帶石斑魚群體自交的子代幼魚群體為樣本.每個群體分別隨機選取30尾，取尾鰭組織固定于φ=95%的酒精中，并帶回實驗室，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用TIANGEN的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA，并以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，于-20℃保存.

1.2.2 雙酶切反應(yīng) 對于每份DNA，同時設(shè)置EcoRI+HpaII(以下記作H組)和EcoRI+MspI(以下記作M組)兩種酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系包括基因組500 ng DNA，5 U EcoRI，5 U HpaII/MspI，4 μL 10×Buffer Tango，加滅菌雙蒸水補足至20 μL.37 ℃水浴酶切6 h，轉(zhuǎn)65 ℃酶切變性10 min，最后用w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.3 連接接頭 連接體系為20 μL，包括5 μL酶切產(chǎn)物，1 μL E接頭，1 μL HM接頭，5 U T4DNA Ligase，4 μL 5×T4DNA Ligase Buffer，加滅菌雙蒸水補足至20 μL.16 ℃連接過夜，產(chǎn)物稀釋10倍以用于預(yù)擴增.

1.2.4 預(yù)擴增反應(yīng) 反應(yīng)總體系為20 μL，其中含2 μL稀釋連接產(chǎn)物，1 μLE0和HM0預(yù)擴引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的 dNTPs，2 μL 10×Taq Buffer以及2 U Taq DNA Polymerase，加滅菌雙蒸水補足至20 μL.預(yù)擴增程序為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行20個循環(huán)，72 ℃10 min.最后用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物稀釋20倍后用于選擇擴增.

1.2.5 選擇性擴增反應(yīng) 反應(yīng)總體系為20 μL，包括4 μL預(yù)擴增稀釋產(chǎn)物，1 μL En選擴引物和HMn選擴引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的dNTPs ，2 μL 10×Taq Buffer以及2U Taq DNA Polymerase，加滅菌雙蒸水補足至20 μL.選擇擴增程序為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，56～65 ℃ 30 s(-0.7℃/cycle)，72 ℃ 1 min，循環(huán)14次；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)23次，72 ℃ 5 min，16 ℃ 保存.最后用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物稀釋10倍.

實驗所用的接頭和引物組合見表1，根據(jù)使用所有選擴引物擴增的結(jié)果，篩選出8對重復(fù)性好、多態(tài)性好、條帶清晰的選擇擴增引物組合以用于本實驗的研究，8對引物組合分別是：選引2—E1HM2，選引5—E1HM5，選引6—E2HM1，選引7—E2HM2，選引8—E2HM3，選引12—E3HM2，選引13—E3HM3，選引17—E4HM2.

表1 所用接頭和引物序列

1.2.6 產(chǎn)物檢測 采用JY-CX2B型電泳槽進(jìn)行6%變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，選擴稀釋產(chǎn)物與上樣緩沖液以2 ∶1的比例混合，95 ℃變性10 min，立即置于冰上待用.采用70 W恒功率預(yù)電泳1 h，取4 μL已變性產(chǎn)物，在70 W恒功率下電泳2 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染.

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 在MSAP圖譜上，對于同一樣品的DNA，分別用HpaII和MspI與EcoRI組合進(jìn)行雙酶切，因此每個樣品對應(yīng)2個泳道，在同一位點，有條帶計為“1”，無條帶計為“0”.統(tǒng)計8對引物擴增出的條帶數(shù)及帶型數(shù)，根據(jù)擴增產(chǎn)物在2個泳道內(nèi)的有無的情況，可以將條帶類型分為4種：(1)A型：H、M兩個泳道都有帶，即“H/M”帶型為“1、1”，其表示該酶切位點沒有發(fā)生甲基化，代表去甲基化位點；(2)B型：H泳道有帶，M泳道無帶，即“H/M”帶型為“1、0”，其表示該酶切位點為單鏈外甲基化，代表半甲基化位點；(3)C型：H泳道無帶，M泳道有帶，即“H/M”帶型為“0、1”，其表示該酶切位點為雙鏈內(nèi)甲基化，代表全甲基化位點；(4)D型：H、M兩個泳道都無帶，即“H/M”帶型為“0、0”，此時有三種情況，即表示該酶切位點存在雙鏈外側(cè)甲基化、雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化或無CCGG序列，此類型位點不做統(tǒng)計.將得到的甲基化條帶進(jìn)行統(tǒng)計，計算各個群體的總甲基化率、全甲基化率及半甲基化率.DNA甲基化的計算方法：全甲基化率=全甲基化條帶數(shù)/總擴增帶數(shù)×100；半甲基化率=半甲基化條帶數(shù)/總擴增帶數(shù)×100；總甲基化率=全甲基化率+半甲基化率.

2 結(jié) 果

2.1 雜交子一代群體的基因組DNA提取及雙酶切 MSAP對DNA的質(zhì)量要求較高，本實驗提取的雜交子一代的DNA瓊脂糖凝膠(w=1%)電泳圖如圖1所示，基因組DNA的樣本基本無RNA及蛋白質(zhì)污染，質(zhì)量較高.經(jīng)EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI雙酶切后，雜交子一代的DNA酶切產(chǎn)物呈一片均勻分布的“Smear”帶，表明酶切充分，符合MSAP對酶切的要求，見圖2.

2.2 預(yù)擴增 雜交子一代基因組DNA雙酶切后，連接接頭，連接產(chǎn)物經(jīng)預(yù)擴增后，用w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，產(chǎn)物條帶大致呈彌散狀，其在100～1 000 bp之間穩(wěn)定存在，擴增效果較好.

2.3 選擇擴增 首先預(yù)擴增稀釋產(chǎn)物，用篩選出的8對選擴引物組合進(jìn)行選擇性擴增，用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測選擴效果，產(chǎn)物條帶區(qū)主要分布在低分子量區(qū)，重復(fù)性好、多態(tài)性好、條帶清晰.圖4是雜交子一代群體選擴引物2的瓊脂糖凝膠(w=2%)電泳圖.

2.4 三個石斑魚群體的甲基化圖譜 用選擴引物2擴增的產(chǎn)物對三個石斑魚群體進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，其擴增結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示了DNA甲基化的三種不同類型的條帶，即“H/M”帶型為“1、1”(A)，“H/M”帶型為“1、0”(B)，“H/M”帶型為“0、1”(C)三種條帶類型.由圖5中可以看出，每個石斑魚群體的DNA甲基化帶型都非常豐富，三種DNA甲基化帶型均有出現(xiàn).

2.5 親子代間DNA的甲基化水平 8對引物對3個群體的擴增結(jié)果顯示，棕點石斑魚、鞍帶石斑魚、雜種子一代擴增出的總條帶數(shù)分別為5 117，6 270，6 300.其中，甲基化總條帶數(shù)分別為2 926，3 960，3 450.母本棕點石斑魚群體的甲基化率平均為57.18%，其中全甲基化率為31.66%，半甲基化率為25.52%；父本鞍帶石斑魚群體的甲基化率平均為63.16%，其中全甲基化率為39.71%，半甲基化率為23.44%；雜交子一代群體的甲基化率平均為54.76%；其中全甲基化率為40.00%，半甲基化率為14.76%(見表2).親子代間的DNA甲基化水平存在較大的差異.

3 討 論

3.1 DNA甲基化水平與雜種優(yōu)勢的相關(guān)分析 DNA甲基化作為真核生物基因組重要的表觀遺傳學(xué)修飾，被認(rèn)為是雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的重要機制.1997年，Reyna-López等[10]首次報道了MSAP技術(shù)，近年來，該技術(shù)日益成熟，由于其操作簡單和具有高效性，因此它已被廣泛應(yīng)用于動植物基因組DNA甲基化水平的研究中.儀治本等[11]分析了三個高粱(Sorghum)雜交種及其相應(yīng)親本的DNA甲基化水平，結(jié)果顯示：這三個雜交種的DNA甲基化水平(41.8%，47.6%，48.7%)都低于雙親的DNA甲基化水平(51.4%～63.0%).李愛等[12]也在落葉松(Larix)中發(fā)現(xiàn)其正反交的優(yōu)勢雜交子代的DNA甲基化水平(20.46%，19.92%)顯著低于中親值(22.99%).劉天嬌[13]在玉米(ZeamaysL)雜交種中也發(fā)現(xiàn)其DNA甲基化水平顯著降低.在牛(Bostaurus)[14]、豬(Susdomesticus)[15]、鯉魚(Cyprinuscarpio)和鯽魚(Carassiusauratus)[16]等動物的雜種優(yōu)勢中也普遍存在DNA甲基化水平的改變.于濤等[17]在扇貝雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，母本櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的甲基化率為24.13%，父本蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的甲基化率為32.79%，而雜交子一代的甲基化率為19.98%，子代的DNA甲基化率低于親本的DNA甲基化率.上述動植物雜種優(yōu)勢的研究顯示，其雜種一代的甲基化程度比親本的甲基化程度低，由此認(rèn)為：甲基化程度的降低是雜種優(yōu)勢的原因之一[18-19].

表2 雜交親子代間的DNA甲基化水平比較

DNA甲基化與基因表達(dá)有關(guān)，雜交子一代在基因組水平上發(fā)生DNA甲基化水平的降低可能會導(dǎo)致部分沉默基因的開啟，這種結(jié)果可能導(dǎo)致雜種的潛在適應(yīng)性提高，從而產(chǎn)生高于親本的優(yōu)勢.本研究在棕點石斑魚、鞍帶石斑魚及雜交子一代中建立了MSAP方法的反應(yīng)體系，獲得了清晰、穩(wěn)定的擴增圖譜.實驗結(jié)果表明，棕點石斑魚、鞍帶石斑魚、雜交子一代石斑魚的基因組DNA總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%，雜種子代的總甲基化率低于親本的總甲基化率.這與其他研究所發(fā)現(xiàn)的雜種一代的甲基化程度比親本的甲基化程度低的結(jié)果相一致，說明在具備雜種優(yōu)勢的子代石斑魚中，其甲基化水平也顯著地降低，推測這有利于雜種優(yōu)勢的形成.

3.2 雜交優(yōu)勢與甲基化水平的關(guān)系存在物種差異 本文在石斑魚雜交子一代約6 000個位點的分析結(jié)果顯示，棕點石斑魚、鞍帶石斑魚、雜交子一代石斑魚的基因組DNA總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%.相較于部分動植物的基因組DNA甲基化水平，如毛竹(Phyllostachysheterocyclavar.pubescens)[20](24.44%～32.12%)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[21](20.8%～24.1%)、背角無齒蚌(Anodontawoodiana)[22](35.5%～56%)，以及哺乳動物如牛[14](33.1%～40.03%)、豬[15](40.6%～44.8%)等來說，本文中的石斑魚群體的基因組DNA甲基化水平屬于程度較高的類群，盡管雜交子一代的甲基化水平仍然較高，但卻獲得了明顯的雜種優(yōu)勢.實驗得到石斑魚雜交子一代的半甲基化率(14.76%)顯著低于親本群體的半甲基化率(25.52%和23.44%)，然而其全甲基化率卻為40.00%，顯著高于母本的全甲基化率(31.66%)，與父本的全甲基化率(39.71%)相近.這不同于在扇貝[17]和牛[14]中所得到的雜交后代的全甲基化率(其低于親本)，但是與親子代間的DNA全甲基化水平均大于半甲基化水平這一結(jié)果相符合.這一方面說明基因組DNA甲基化水平的高低存在物種的差異性；另一方面也提示雜種子代的DNA甲基化水平相對降低對雜種優(yōu)勢更具意義.

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Methylation-sensitive Amplification Polymorphism Analysis of Genomic DNA Methylation onEpinepheluslanceolatus,Epinephelusfuscoguttatusand Their Hybrid Generation

Zhou Ying, Han Yulong, Luo Jian, Wang Qian, Chen Guohua

(State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228, China)

To investigate the generation mechanism of heterosis in fish hybrids,Epinephelusfuscoguttatus,Epinepheluslanceolatusand their hybrids populations were used as the objects of research, methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to analyze the DNA cytosine methylation of their genome. The results showed that the MSAP values of the three groups were 57.18%, 63.16%, and 54.76%, respectively. The full-methylation ratios of these populations were 31.66%, 39.71% and 40.00%, respectively, and the half-methylation ratios were 25.52%, 23.44%, and 14.76%, respectively. Compared with their parental lines, the DNA methylation level of the hybrids was changed significantly, and at the different sites, the heterosis of the groupers should benefit from the DNA methylation and DNA demethylation.

grouper; DNA methylation; MSAP; heterosis

2017-02-26

國家“863”計劃項目(2012AA10A407)，海南省重點研發(fā)項目(ZDYF2016085).

周瑩(1992-)，女，河北邯鄲人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2014級碩士研究生，E-mail:1499364556@qq.com

駱劍(1980-)，男，湖南衡山人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：魚類生殖與遺傳. E-mail:luojianfish@aliyun.com

1004-1729(2017)02-0145-07

S 917.4

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0026