張穎 周明學(xué) 李思耐 任攀 劉衛(wèi)紅 尚菊菊 劉紅旭

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·論著·

參元丹膠囊對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊的干預(yù)作用及胰島素抵抗標(biāo)志蛋白GLUT-4的影響

張穎 周明學(xué) 李思耐 任攀 劉衛(wèi)紅 尚菊菊 劉紅旭

目的 參元丹膠囊對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)小鼠主動脈斑塊的干預(yù)作用及胰島素抵抗標(biāo)志蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(glucose transport protein-4，GLUT-4)的影響。方法 將50只8周齡雄性ApoE-/-小鼠西方類型膳食喂養(yǎng)6周后隨機分為模型組、立普妥(陽性對照組)、參元丹高劑量組、中劑量組和低劑量組(n=10)，給予藥物腹腔注射6周。檢測其血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血清游離脂肪酸、空腹血糖和空腹血清胰島素水平。行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining, HE)，圖像分析測量小鼠主動脈AS斑塊面積。免疫組化法檢測各組小鼠主動AS斑塊內(nèi)GLUT-4的表達。結(jié)果 與模型組相比，參元丹膠囊中劑量組小鼠血清TC水平明顯降低(P<0.01)、參元丹膠囊中、低劑量組小鼠血清TG水平明顯降低(P<0.05)、參元丹膠囊3個劑量組LDL-C水平明顯降低(P<0.05，)，參元丹膠囊中、低劑量組HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，參元丹膠囊3個劑量組小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)顯著降低(P<0.05)，高、中、低劑量組小鼠血清游離脂肪酸濃度顯著降低(P<0.05)。參元丹膠囊3個劑量組小鼠空腹血糖水平無顯著差異(P>0.05)，血清胰島素水平顯著降低(P<0.05)，中劑量組胰島素抵抗指數(shù)顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，參元丹膠囊中、高劑量組小鼠主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4表達顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 參元丹膠囊可能通過調(diào)控GLUT-4表達改善胰島素抵抗，從而達到抗AS的作用。

動脈粥樣硬化； 參元丹膠囊； 血脂異常； 胰島素抵抗； 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是多種代謝性心腦血管疾病的共同致病基礎(chǔ)，是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的危險因素之一。大量研究表明：IR可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)加強及脂質(zhì)代謝紊亂，從而促進AS的發(fā)生和進展[1]。參元丹膠囊為北京中醫(yī)醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑，是根據(jù)冠心病心絞痛氣虛血瘀證的臨床特點，基于中醫(yī)絡(luò)病理論，以益氣逐瘀法為組方原則的經(jīng)驗方劑。既往研究表明參元丹膠囊具有保護缺血心肌抗心肌脂質(zhì)過氧化、保護缺血再灌注損傷、防止心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬等藥理作用[2-6]，但其是否可通過改善IR起到抗AS的作用尚未見相關(guān)報道。因此，本實驗擬采用西方類型膳食喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠(apolipoprotein Eknocknout，ApoE-/-)為AS小鼠模型，研究參元丹膠囊對AS小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)、IR指數(shù)和IR標(biāo)志性蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(glucose transport protein-4，GLUT-4)表達的影響。

1 材料

1.1 實驗試劑和儀器

血清總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒(批號7007210506)、血清甘油三酯(triglyceride,TG)檢測試劑盒(批號7006210506)、血清低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)檢測試劑盒(批號7021220605)、血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒(批號7020210506)和小鼠血清血糖試劑盒(批號7026210504)，均購自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司。小鼠血清游離脂肪酸試劑盒(批號C06610101)購于英國朗道公司。小鼠血清胰島素試劑盒(貨號CK-E00728M)購于美國R&D公司。血生化指標(biāo)檢測采用日本奧林巴斯株式會社全自動生化儀(AU480)。美國Image-ProPlus Version 5.0(IPP) 圖像分析軟件。

1.2 實驗藥物

阿托伐他汀鈣，商品名立普妥，上海輝瑞制藥公司，批號H20051408。參元丹膠囊，批號Z20053327。

1.3 動物及分組

6～8周齡ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，8周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，50只，高脂飼養(yǎng)6周后，所有小鼠隨機分為模型組、立普妥組(陽性對照組)3.34 mg/kg、參元丹膠囊高劑量組160 mg/kg、中劑量組80 mg/kg和低劑量組40 mg/kg，每組10只。參元丹膠囊高劑量、中劑量和低劑量分別選取臨床常用劑量的2倍、臨床劑量和臨床常用劑量的1/2，并按成人與小鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量灌胃給藥[7]，每日1次，灌胃給藥6周。模型組給予等量的生理鹽水。高脂飼料配方為脂肪21%(wt/wt)、膽固醇0.15%的西方類型膳食飼料[8]。各組動物在喂養(yǎng)12周后，頸椎脫臼法處死，眶下靜脈叢取血，保留血清，無菌條件下取心臟，心臟用4%多聚甲醛固定。

1.4 血脂檢測

采用氧化酶法和直接法檢測參元丹膠囊對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。動脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index，AI)= (TC-HDL-C)/HDL-C。

1.5 血清游離脂肪酸、空腹血糖和血清胰島素水平檢測

采用比色法檢測小鼠血清游離脂肪酸(nonesterified fatty acid，NEFA)水平，采用氧化酶法檢測小鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平，采用ELISA法檢測小鼠空腹血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)Ins)水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA insulin resistance index,HOMA-IR)=(FBG×FIns )/22.5，HOMA-IR>2.7為胰島素抵抗模型制作成功[9]。

1.6 組織病理

小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片，每隔50 μm連續(xù)取6張切片，切片厚5 μm。按Suzuki等[10]確立的方法，主動脈根部以主動脈瓣為標(biāo)志選取4個切面，分別為：(1)升主動脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；(2)主動脈瓣起始橫截面；(3)主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；(4)主動脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。在實驗中統(tǒng)一選取第三切面，做病理HE染色。IPP圖像軟件分析測量小鼠主動脈AS斑塊面積，具體如下：

測量管腔面積(lumen area，LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積 (internal elastic laminal area，IELa)，并計算斑塊面積、校正后斑塊面積。公式換算如下：斑塊面積(plaque area，PA)(mm2)=IELa-LA；校正后斑塊面積=PA/IELa。

1.7 免疫組化法檢測

免疫組化染色選取第三切面，采用兩步法測定斑塊內(nèi)GLUT-4表達(抗體稀釋度為1∶100)，每組均以PBS 代替一抗作為陰性對照，在100 倍鏡下每張切片選取5個不同的視野，對陽性區(qū)域累積面積進行定量測定，最后求取斑塊內(nèi)陽性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠動脈粥樣硬化模型的建立

高脂喂養(yǎng)12周后，ApoE-/-小鼠主動脈出現(xiàn)典型的AS斑塊，其主動脈管壁上可觀察到典型的富含膽固醇結(jié)晶和膽固醇酯的AS斑塊，斑塊有成熟的纖維帽覆蓋(圖1B，黑箭頭所示)，斑塊內(nèi)及血管外面有大量炎性細(xì)胞，主動脈中層結(jié)構(gòu)被破壞，說明復(fù)制小鼠AS模型建立成功。

注：A為高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠主動脈根部病理形態(tài)HE染色圖(×100)；B為A圖的局部放大，黑箭頭指示主動脈壁AS斑塊(×200)。

圖1 高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化模型的建立

2.2 參元丹膠囊對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血脂和動脈粥樣硬化指數(shù)的影響

小鼠灌胃6周后，與模型組相比，參元丹中劑量組小鼠血清TC水平明顯降低(P=0.002)，參元丹膠囊中、低劑量組小鼠血清TG 水平明顯降低(P=0.002，P=0.006)、參元丹膠囊高、中、低3個劑量組LDL-C水平均明顯降低(P=0.017，P=0.001，P=0.012)，參元丹膠囊中、低劑量組HDL-C水平明顯升高(P=0.004，P=0.001 )，參元丹膠囊高、中、低3個劑量組小鼠AI顯著降低(P=0.0005，P=0.0004，P=0.0003)，與陽性對照立普妥組相比，參元丹膠囊高劑量和低劑量組小鼠血脂各指標(biāo)和AI均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3 參元丹膠囊對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的影響

藥物干預(yù)6周后，經(jīng)HE染色和IPP圖像軟件分析結(jié)果顯示：與模型組相比，參元丹膠囊高、中、低三個劑量組小鼠的校正后主動脈AS斑塊面積顯著降低(P=0.00001，P=0.00002，P=0.00005)，與陽性對照立普妥組之間無顯著差異(P>0.05)。見圖2、表2。

表1 各組動脈粥樣硬化小鼠血脂水平和AI的比較±s)

注： 與模型組相比，aP<0.05。

注：黑箭頭指示AS斑塊。

圖2 各組動脈粥樣硬化小鼠主動脈AS斑塊面積的比較(HE染色，×200)

注：黑箭頭指示AS斑塊。

圖3 各組動脈粥樣硬化小鼠主動脈AS斑塊內(nèi)GLUT-4表達比較(HE染色，×200)

表2 各組動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊面積及GLUT-4表達的比較

注： 與模型組相比，aP<0.05。

2.4 參元丹膠囊對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4表達的影響

藥物干預(yù)6周后，免疫組化結(jié)果顯示：與模型組相比，立普妥組和參元丹膠囊中劑量和高劑量組小鼠主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4表達面積百分比明顯增多(P=0.0003，P=0.0002)，參元丹膠囊中劑量組和高劑量組與陽性對照藥立普妥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.5 參元丹膠囊對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠NEFA、FBG、FIns和HOMA-IR的影響

藥物干預(yù)6周后，與模型組相比，參元丹膠囊高、中、低三個劑量組小鼠NEFA水平顯著降低(P=0.0005，P=0.0004，P=0.0006)，F(xiàn)BG水平均無顯著改變(P>0.05)，F(xiàn)Ins水平顯著降低(P=0.0003，P=0.0002，P=0.0002)，參元丹膠囊中劑量組HOMA-IR顯著降低(P=0.004)。與陽性對照藥立普妥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

IR可通過促進血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)代謝紊亂，從而促進AS的發(fā)生和進展[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)參元丹膠囊具有保護缺血心肌、抗心肌脂質(zhì)過氧化、保護缺血再灌注損傷、防止心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬等藥理作用[2-6]，但其是否可通過改善IR起到抗AS的作用尚未見相關(guān)報道。

表3 各組動脈粥樣硬化小鼠NEFA、FBG、FIns、HOMA-IR的比較

注： 與模型組相比，aP<0.05。

參元丹膠囊是國家中醫(yī)心血管病重點?？茖W(xué)科帶頭人、北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科劉紅旭主任研制的院內(nèi)制劑，根據(jù)冠心病心絞痛氣虛血瘀證的臨床特點，基于中醫(yī)絡(luò)病理論，以益氣逐瘀法為組方原則的經(jīng)驗方劑。在重用黃芪、黨參益氣扶正的基礎(chǔ)上，選用水蛭、土鱉蟲破血逐瘀，并配以玄參、丹參、地龍、延胡索。從絡(luò)病論治理論來看，方中水蛭、土鱉蟲、地龍均為蟲蟻之類，藉其“蠕動之物可以松透病根”而直入絡(luò)分幽微之所，搜剔血絡(luò)，透毒外出，則絡(luò)脈瘀滯瘀毒可除；“邪之所湊，其氣必虛”，故又兼顧其絡(luò)脈空虛，以黨參補中益氣，黃芪扶助正氣，玄參滋而不膩，充養(yǎng)絡(luò)脈。丹參養(yǎng)血活血，延胡索行氣活血止痛，共奏益氣逐瘀、行氣通絡(luò)之效[11]。本研究結(jié)果表明參元丹膠囊可不同程度改善AS小鼠的血脂水平和動脈粥樣硬化指數(shù)，以參元丹中劑量組即臨床常用劑量治療效果為優(yōu)，說明參元丹膠囊具有較好的調(diào)整血脂和抗AS作用。

Stern根據(jù)IR和AS之間的相關(guān)性提出了“共同土壤學(xué)說”，認(rèn)為IR是心腦血管疾病中眾多代謝性異常的致病基礎(chǔ)和原始動因[12]。IR可通過影響體內(nèi)C肽及脂聯(lián)素的水平，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起AS[13]。本研究結(jié)果也表明，參元丹膠囊具有較好的減輕AS小鼠空腹血清胰島素HOMA-IR的作用，這說明改善IR可能是參元丹膠囊抗AS的作用機制之一。

GLUT-4是一種含509個氨基酸的糖蛋白，主要存在于對胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪組織，是這些組織細(xì)胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運體，破壞小鼠肌肉中Glut4基因可導(dǎo)致IR和葡萄糖耐量減退[14]。GLUT-4是發(fā)生IR的標(biāo)志性蛋白之一。高脂飲食可通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致外周IR，如胰島素受體數(shù)目、胰島素受體底物-1及GLUT-4水平在高脂飲食后均可下降，從而限制了進入細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖流量，使得細(xì)胞進行糖代謝減少。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，高脂飲食可下調(diào)白色脂肪組織中的GLUT-4mRNA的水平，并明顯減弱由胰島素刺激的脂肪細(xì)胞GLUT-4的轉(zhuǎn)位及葡萄糖的攝取。課題組的研究結(jié)果表明，參元丹膠囊可明顯增加動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4蛋白的表達，提示參元丹膠囊可能通過增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運，改善IR，進而發(fā)揮抗AS作用。

綜上，參元丹膠囊具有較好的調(diào)整血脂、減少主動脈斑塊面積、降低血清胰島素和胰島素指數(shù)，并可升高主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4表達作用。參元丹膠囊可能通過調(diào)控主動脈斑塊內(nèi)GLUT-4表達改善IR，從而達到抗ApoE-/-小鼠主動脈AS的作用，但其具體的作用機制還需深入研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Effects ofShenyuandancapsule on atherosclerotic plaque and the expression of GLUT-4 in atherosclerotic mice

ZHANGYing，ZHOUMingxue，LISinai，etal.

DepartmentofTCM，BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity，Beijing100149，China

LIUHongxu，E-mail：lxh_263.net

Objective To study the effect ofShenyuandancapsule on atherosclerotic plaque and the expressions of insulin resistance marker protein glucose transport protein-4(GLUT-4)in aorta of atherosclerotic mice. Methods Fifty 8 week-old male ApoE-/-mice were fed with a western type diet for 6 weeks, and the rats were randomly divided into control group, Lipitor (positive control group),Shenyuandancapsule (high-dose group, SYDC-H, middle-dose group, SYDC-M，and low-dose group, SYDC-L ), 10 rats in each group, and have been intraperitoneally injected for 6 weeks. The levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), serum free fatty acid, fasting blood glucose and fasting insulin levels in serum of ApoE-/-mice were detected. HE staining was used to measure the area of AS plaque in aortic. Immunohistochemical method was used to detect the expression of GLUT-4 in plaques of AS mice. Results Compared with the control group, the TC levels of SYDC-M group were significantly reduced, the TG levels of the mice of SYDC-M group and SYDC-L group were significantly decreased, the LDL-C levels of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were significantly decreased and the HDL-C levels of SYDC-M group and SYDC-L were significantly increased (P<0.05). The atherosclerosis indexes of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were decreased significantly (P<0.05). The levels of free fatty acids in serum of SYDC-L group，SYDC-M group and SYDC-H group were significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in fasting plasma glucose level (P>0.05), the insulin level of SYDC-H group, SYDC-M group and SYDC-L group were significantly decreased (P<0.05) and the insulin resistance indexes of SYDC-M group were significantly decreased (P<0.05). Compared with the control group, the expressions of GLUT-4 in the aortic plaques of SYDC-H group and SYDC-M group were significantly increased(P<0.05). ConclusionShenyuandancapsule may be possible to improve the insulin resistance by regulating the expression of GLUT-4, so as to achieve the effect of anti AS.

Atherosclerosis;Shenyuandancapsule; Dyslipidemia; Insulin resistance; Glucose transport protein-4

國家自然科學(xué)基金( 81673744)；北京市自然科學(xué)基金(7162043)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才項目( 2014-3-100)

100149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院中醫(yī)科(張穎)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)研究所(周明學(xué)、李思耐、任攀、劉衛(wèi)紅)，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)心內(nèi)科(劉紅旭、尚菊菊)

張穎(1979- ),女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心內(nèi)科研究。E-mail：zhyxr15@126.com

劉紅旭(1963- )，本科，教授。研究方向：心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail：lxh_263.net

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.001

2017-02-22)