沈 飛 吳啟芳 姜大峰 魏穎琪唐培安 劉 兵 宋 偉

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，南京 210023) (山東省疾病預(yù)防控制中心2，濟(jì)南 250014)

基于電子鼻技術(shù)的糙米黃曲霉毒素污染快速檢測方法研究

沈 飛1吳啟芳1姜大峰2魏穎琪1唐培安1劉 兵1宋 偉1

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，南京 210023) (山東省疾病預(yù)防控制中心2，濟(jì)南 250014)

為驗(yàn)證電子鼻技術(shù)用于糧食真菌毒素污染快速檢測的可行性，本研究利用Fox3000型電子鼻對(duì)受黃曲霉毒素侵染的糙米樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了檢測分析，建立了電子鼻響應(yīng)信號(hào)與黃曲霉毒素水平的相關(guān)關(guān)系模型。結(jié)果顯示，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法可較好區(qū)分不同黃曲霉毒素含量水平的糙米樣品，模型的留一交互驗(yàn)證正確率高于80%。PLS回歸分析顯示電子鼻響應(yīng)信號(hào)與糙米中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2及總量之間呈現(xiàn)較高相關(guān)性，其中對(duì)黃曲霉毒素B1的預(yù)測精度最高，預(yù)測相關(guān)系數(shù)和均方根誤差分別達(dá)到0.808和127.3 μg/kg。進(jìn)一步，通過對(duì)電子鼻各氣體傳感器響應(yīng)信號(hào)的載荷分析確定了各傳感器貢獻(xiàn)率的差異，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)揭示了受黃曲霉毒素污染糙米樣品的揮發(fā)性組分的變化主要體現(xiàn)在酮醛類、醇類、芳香烴類和烷烴類上。結(jié)果表明，利用電子鼻對(duì)糙米的黃曲霉毒素污染的快速檢測具有一定可行性，為糧食真菌毒素污染的早期預(yù)警提供一種新思路和新方法。

糙米 黃曲霉毒素 電子鼻 快速檢測 偏最小二乘回歸

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由黃曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)和模式曲霉(A.nomius)等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)致畸、致癌和致突變特性，廣泛分布于霉變的稻谷、玉米、花生等糧食及相關(guān)食品中[1]。谷物中常見的AF有B1、B2、G1和G2等4種形式，其中，以AFB1毒性最強(qiáng)，1993年被國際癌癥研究組織(IARC)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約25%的糧食因監(jiān)管不當(dāng)發(fā)生霉變，甚至侵染真菌毒素，不僅造成巨額經(jīng)濟(jì)損失，且嚴(yán)重威脅人畜健康[3]。目前，AF檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[6]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7]等，然而，上述方法或者操作繁瑣、成本高，或者靈敏度低、準(zhǔn)確性差，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的AF檢測方法，對(duì)確保糧食質(zhì)量與安全具有重要意義。

電子鼻作為一種快速、無損的氣味檢測手段，已廣泛用于果蔬[8]、肉禽[9]、茶酒[10]和油脂[11]等各類食品質(zhì)量檢測中。近年來，越來越多的學(xué)者報(bào)道了電子鼻技術(shù)在糧食品種及品質(zhì)[12]、蟲害[13]、新鮮度[14]和霉變程度[15]等檢測中的應(yīng)用，且對(duì)谷物真菌毒素污染的檢測研究已有少量報(bào)道。Lippolis等[16]采用電子鼻進(jìn)行侵染不同水平脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)硬質(zhì)小麥的檢測，完整顆粒與粉碎后樣品判別模型的判別正確率分別為69.3%和86.7%。Olsson等[17]采用電子鼻檢測大麥中DON的含量水平，PLS模型預(yù)測均方根誤差為25 μg/kg。Abramson等[18]對(duì)20%含水量的小麥中的赭曲霉毒素和黃綠青霉毒素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，電子鼻傳感器響應(yīng)值與這2種毒素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.87和0.83。

然而，利用電子鼻技術(shù)檢測糧食真菌毒素污染還處于探索階段，且研究對(duì)象多集中在麥類、玉米和花生等，對(duì)稻米的研究較少。因此，本試驗(yàn)擬采用電子鼻檢測侵染AF糙米樣品的氣味信息，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法建立糙米AF含量的定性及定量分析模型，研究基于氣味信息進(jìn)行侵染AF糙米檢測的可行性，為建立糧食真菌毒素污染的早期、實(shí)時(shí)監(jiān)測及預(yù)警系統(tǒng)提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糙米樣品采自黑龍江省(2014年收獲)，密封，4 ℃冷藏待用；2種產(chǎn)AF標(biāo)準(zhǔn)菌株：黃曲霉3.17和寄生曲霉3.395，均購于中國北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院，適宜條件下(28 ℃、85% RH)活化后，-18 ℃冷藏；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混標(biāo)：美國Sigma公司。

1.2 樣品制備與分析

1.2.1 霉菌培養(yǎng)與接種

首先，將黃曲霉和寄生曲霉置于高鹽察氏培養(yǎng)基上，在28 ℃、85% RH條件下培養(yǎng)7 d，采用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面，參照GB 4789.3—2010，采用平板計(jì)數(shù)法分別測定2種霉菌孢子懸浮液的濃度，并調(diào)整至約6.0×106CFU/mL。其次，將經(jīng)鈷-60(12kGy)輻照滅菌的糙米樣品以250 g/份分裝為16份。其中8份噴灑接種寄生曲霉3.395，另8份接種黃曲霉3.17，平板計(jì)數(shù)確定接種濃度，約為1.02×105CFU/g。然后，將所有樣品置于28 ℃、85% RH條件下儲(chǔ)藏30 d后取樣分析。

1.2.2 HPLC檢測

參照GB/T 5009.23—2006，采用HPLC法測定樣品中AF含量。步驟簡述如下：準(zhǔn)確稱取50 g粉碎后的糙米樣品，加入200 mL乙腈-水(84/16)振蕩提取30 min。取8 mL提取液至MycoSepTM226多功能柱過濾，取濾液2 mL于50 ℃下N2吹干。然后，加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，于40 ℃下衍生反應(yīng)15 min。室溫下干燥后，加入1 mL乙腈/水(15/85)復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，裝瓶進(jìn)行測定。檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。進(jìn)樣體積和流速分別為10 μL、1.0 mL/min。每份樣品重復(fù)測定3次，取平均值進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

1.2.3 AF梯度濃度樣品準(zhǔn)備

HPLC檢測結(jié)果顯示空白樣品中未檢出AF，而16份接種霉菌樣品中AF含量均偏高。因此，為得到更具代表性和AF濃度范圍分布較廣的樣品，首先，分別將空白和侵染AF樣品磨粉，過篩(粒徑<40目)。然后，準(zhǔn)確稱取含AF樣品10 g，按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(m/m)7個(gè)質(zhì)量比例分別摻入空白樣品，共計(jì)得到AF的含量范圍為0～2 406.40 μg/kg的糙米樣品128份(16份空白+16×7份AF侵染樣品)。

1.3 電子鼻檢測試驗(yàn)

稱取3 g樣品，轉(zhuǎn)移至20 mL頂空瓶中，密封，進(jìn)行電子鼻(α Fox3000，法國)檢測。參數(shù)條件如下：采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣方式，平衡溫度和時(shí)間分別為60 ℃、120 s；采樣體積、頻次和速度分別為1 mL、1次/s、1 mL/s；載氣流速為150 mL/min；檢測時(shí)間為60 s。采用儀器自帶軟件收集每份樣品所對(duì)應(yīng)的12個(gè)傳感器(表1)的響應(yīng)信號(hào)，提取每個(gè)傳感器響應(yīng)信號(hào)的最大特征值。每份樣品測定2次，取平均值進(jìn)行分析。

表1 Fox 3000型電子鼻12個(gè)傳感器的檢測范圍

1.4 GC-MS檢測試驗(yàn)

稱取15 g樣品，置于100 mL頂空瓶中，于60 ℃水浴平衡50 min，插入50 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭(美國Supelco公司)萃取1 h，采用GC(7890A)-MS(5975C) 氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(美國安捷倫公司)進(jìn)行檢測，解析時(shí)間為5 min。參數(shù)條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為N2，流速為24.00 mL/min；AUX-2溫度為280 ℃；離子源為EI，溫度為230 ℃；電子能量70 eV；采集模式為全掃描。通過與計(jì)算機(jī)中NIST08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫匹配實(shí)現(xiàn)樣品中未知揮發(fā)性組分的定性分析，僅采用匹配度大于80(最大值為100)的揮發(fā)性物質(zhì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用MATLABv8.4和SPSSv16.0 軟件對(duì)傳感器響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行處理。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、線性判別分析(LDA)和支持向量機(jī)判別分析(SVM-DA)建立判別模型，運(yùn)用留一交互驗(yàn)證法對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。采用PLS法建立AF含量預(yù)測分析模型，以建模集/驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)(rc/rv)、模型均方根誤差(RMSEC)、交互驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)和相對(duì)分析誤差(RPD)作為評(píng)價(jià)模型性能的指標(biāo)，r、RPD值越大，RMSEC、RMSECV和RMSEP值越小，模型性能越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙米樣品的電子鼻信號(hào)響應(yīng)分析

圖1為受AF感染糙米樣品的電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線圖，曲線上的點(diǎn)表示揮發(fā)性成分進(jìn)入電子鼻系統(tǒng)時(shí)各個(gè)傳感器相對(duì)電導(dǎo)率(G/G0)隨檢測時(shí)間的變化情況。觀察可知，初始測定階段各傳感器相對(duì)電導(dǎo)率變化速率大，在10～20 s間，12個(gè)傳感器均達(dá)到最大響應(yīng)值，20 s后逐漸趨于平緩。其中，P10/1、P10/2和P40/1的相對(duì)電導(dǎo)率變化最大，其次為T30/1、PA/2和T70/2，P型傳感器的變化最小。結(jié)果表明，電子鼻對(duì)糙米樣品的揮發(fā)性氣味成分有明顯響應(yīng)，且不同傳感器對(duì)其響應(yīng)靈敏度存在差異。結(jié)合各傳感器的檢測范圍初步確定霉變糙米產(chǎn)生較多的烷烴類、醇類和芳香類化合物，從而引起特征傳感器響應(yīng)值產(chǎn)生顯著變化，而胺類、硫化物及氧化性類氣體成分較少，其響應(yīng)值相對(duì)較弱[19]。

圖1 糙米樣品的傳感器響應(yīng)信號(hào)圖

2.2 電子鼻信號(hào)載荷分析

圖2為128份糙米樣品電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的載荷分析圖。其中，第一和第二主成分的總貢獻(xiàn)率為90.63%，表明其在樣品分析中發(fā)揮主要作用。由圖2可知，各個(gè)傳感器貢獻(xiàn)率存在顯著差異。其中，LY2/GH、LY2/LG、LY2/G、LY2/gCTL和LY/gCT這5個(gè)傳感器的分布位置與(0，0)接近，且較為集中，說明其對(duì)糙米響應(yīng)信號(hào)的差異較小，其貢獻(xiàn)率較低，可能與樣品中含較少的胺類，硫化物及氧化性氣體有關(guān)。P10/2、P40/1、P10/1的權(quán)重最高，T70/2、PA/2和T30/1次之，表明樣品受霉菌感染后產(chǎn)生較多的烷烴類、醇類和芳香烴類氣體，從而引起傳感器信號(hào)變化，并在后續(xù)分析中起到主導(dǎo)作用。

圖2 糙米樣品電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的載荷分析圖

2.3 糙米揮發(fā)性組分結(jié)果分析

采用GC-MS分別測定了空白組、侵染黃曲霉組和侵染寄生曲霉組樣品(每組5個(gè)代表性樣品)，結(jié)果顯示3組樣品的揮發(fā)性成分中以烷烴類最多，其次為酸酯類、烯類和醛類，而醇類、酮類和芳香烴類相對(duì)較少，結(jié)果驗(yàn)證了傳感器P10/1、P10/2和P40/1的響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)。對(duì)比空白組與侵染霉菌組，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)的種類存在明顯差異，其中，1-辛烯-3-醇、3-辛醇、1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、3-辛酮、乙醛、2-十二烯醛、2-壬烯醛和2-甲基-呋喃等僅在侵染霉菌組中檢出，空白樣品中未檢出，與前人研究結(jié)果一致[20]，說明此類物質(zhì)與霉菌代謝活動(dòng)存在密切聯(lián)系。依據(jù)特征氣體的類型，發(fā)現(xiàn)上述物質(zhì)主要與傳感器P10/1、PA/2、T30/1、T70/2和LY2/AA的響應(yīng)密切相關(guān)，同載荷分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)，為電子鼻檢測霉變糙米的揮發(fā)性組分提供了理論依據(jù)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，2種霉菌所產(chǎn)生的揮發(fā)性組分存在一定差異，其中二甲基苯和呋喃酮只在黃曲霉組中檢出，而2-庚烯醛和丁基十四烷基酯則只在寄生曲霉組中測出，表明利用揮發(fā)性成分區(qū)分不同的霉菌感染具有一定可行性。然而，由于樣品霉變產(chǎn)生大量揮發(fā)性成分，組成十分復(fù)雜，不僅包含次級(jí)代謝產(chǎn)物的氣味信息，也包含初級(jí)代謝產(chǎn)物的信息，且本研究中所使用的霉菌種類較少，因此與有害霉菌以及黃曲霉毒素密切相關(guān)的指示性氣體的確定還需進(jìn)一步研究。

2.4 糙米樣品中AF水平判別分析結(jié)果

參考?xì)W盟對(duì)食品中AF的限量標(biāo)準(zhǔn)，將樣品劃分為3組，如表2所示。提取糙米樣品傳感器響應(yīng)信號(hào)的前10個(gè)主成分，采用留一交互驗(yàn)證法，建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、線性判別分析(LDA)和支持向量機(jī)判別分析(SVM-DA)模型，判別結(jié)果如表3所示。在PLS-DA中，AFB1、B2、G1、G2和AFs建模集的整體判別正確率均大于85.0%。驗(yàn)證集中，AFG1和G2模型的判別正確率最高，為82.7%和82.4%，AFB1、B2和AFs的正確率略有下降，但均高于80.0%，顯示出一定的區(qū)分效果。與PLS-DA結(jié)果相比，LDA模型的判別正確率稍低，其中，建模集的判別正確率均大于80.0%，但驗(yàn)證集誤判率偏高。SVM-DA模型的結(jié)果不佳。圖3為AFB1的判別函數(shù)得分圖(其他黃曲霉毒素的判別函數(shù)圖類似)。觀察可知，3組樣品間存在一定的整體分離趨勢，但是部分樣品存在重疊，與模型判別結(jié)果一致。判別分析結(jié)果表明，利用電子鼻技術(shù)快速區(qū)分不同AF含量的糙米樣品具有一定可行性，但模型精度有待進(jìn)一步提升。

表2 糙米樣品AF分組情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果/μg/kg

表3 侵染不同AF濃度糙米樣品判別分析結(jié)果

圖3 糙米樣品中AFB1含量的判別函數(shù)得分圖

2.5 糙米樣品中AF水平定量分析結(jié)果

表4為128份糙米樣品中AFB1、B2、G1、G2和AFs含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由表4可知，AFs含量范圍覆蓋廣，包含多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品/食品侵染AF的水平，有利于模型的建立。為確保樣本選取的隨機(jī)性和代表性，采用Kennard-stone(KS)算法[21]選取86個(gè)樣品作為建模集(86)，其余42個(gè)樣品作為驗(yàn)證集(42)。采用PLS方法建立電子鼻響應(yīng)信號(hào)值與AF含量的定量分析模型，結(jié)果見表5。建模集中，AFB1、B2、G1、G2和AFs模型的rc均大于0.80，其中AFB1和B2的相關(guān)系數(shù)最高，分別為0.871和0.860，其次為AFs，AFG1和G2的稍低。由于AFB1、B2、G1、G2和AFs含量覆蓋范圍不同，導(dǎo)致不同模型間RMSEC和RMSECV值差異較大[22]。驗(yàn)證集中，AFB1模型的預(yù)測精度最高，rv=0.808，RMSEP=127.3 μg/kg。AFB2、G1和AFs模型的rv均大于0.74，預(yù)測精度略低。AFG2模型的精度最低，rv和RMSEP分別為0.715、14.0 μg/kg?？傮w而言，各分析模型的RPD值普遍不高，定量精度較差。但各模型的RPD值均達(dá)到或接近1.5，有一定定性分析潛力，可用于樣品污染狀況的初步篩選[23]。模型精度不佳的主要原因在于樣品中AF含量極低，其特征揮發(fā)性成分也十分復(fù)雜，且受到樣品預(yù)處理步驟和樣品中其他氣味成分的干擾，因此造成電子鼻傳感器信號(hào)噪音較大。進(jìn)一步應(yīng)該改善樣品預(yù)處理措施，優(yōu)化傳感器特征信號(hào)提取手段和建模算法，來提高模型精度，進(jìn)一步提升模型的穩(wěn)健性和適用性。

表4 糙米中AF含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果/μg/kg

表5 糙米中AF的PLS模型的建模及驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

載荷分析及GC-MS結(jié)果顯示酮醛類、醇類、芳香烴類及烷烴類物質(zhì)對(duì)侵染AF糙米的檢測分析具有重要作用，但與AF密切相關(guān)的指示性氣味的鑒定還需進(jìn)一步研究。PLS-DA可較好的區(qū)分侵染不同AF水平的糙米。多元回歸分析結(jié)果顯示電子鼻信號(hào)與AFB1、B2、G1、G2和AFs的含量有緊密相關(guān)性，其中PLS對(duì)AFB1的預(yù)測精度最高(rv=0.808，RMSEP=127.3 μg/kg)。初步研究表明，利用電子鼻進(jìn)行侵染AF糙米的檢測具有一定潛力，但離實(shí)際應(yīng)用仍有一定距離。后續(xù)研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣品數(shù)量和種類，如采用自然侵染AF樣品，并優(yōu)化分析步驟來提升模型性能，為糧食真菌毒素污染的早期監(jiān)測與預(yù)警提供一種新方法。

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Rapid Detection of Aflatoxin Contamination in Brown Rice Based on Electronic Nose Technology

Shen Fei1Wu Qifang1Jiang Dafeng2Wei Yingqi1
Tang Peian1Liu Bing1Song Wei1

(College of Food Science and Engineering; Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety; Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics1, Nanjing 210023) (Shandong Center for Disease Control and Prevention2, Jin′an 250014)

In order to explore the feasibility use of electronic nose (E-nose) for mycotoxin contamination detection in grain, the analysis for volatile compounds of brown rice contaminated with aflatoxin was carried out using a Fox 3000 E-nose system. The corresponding correlation models between aflatoxin levels in brown rice and the responses of E-nose signals were established. The results showed that samples contaminated with different levels of aflatoxin could be distinguished by partial least square-discriminant analysis (PLS-DA) algorithm, and the overall correct classification rate in leave-one-out cross validation was over 80%. In addition, good calibration statistics were obtained for the prediction of aflatoxin B1, B2, G1, G2and total aflatoxins in samples by PLS regression analysis. The best result was obtained for aflatoxin B1. The correlation coefficient and root-mean-square error of prediction obtained was 0.808 and 127.3 μg/kg, respectively. Further, the contribution rate of E-nose sensors was revealed by loadings analysis. Gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) indicated that the changes in volatile compounds of aflatoxin-contamination samples could be mainly attributed to ketones, aldehydes, alcohols, aromatics and alkanes. Overall, the results demonstrated that E-nose offered the feasibility as a rapid tool for the screening of aflatoxin-contamination in brown rice. This methodology provided a new idea and approach for early detection of mycotoxin contamination in grain.

brown rice, aflatoxin, electronic nose, rapid detection, PLS regression

國家自然科學(xué)基金青年基金(31301482)，江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20131007)，江蘇省高校自然科學(xué)研究基金(13KJB550009), 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(JSYXK201403)

2015-11-24

沈飛，男，1984年出生，副教授，糧食儲(chǔ)藏和檢測技術(shù)研究

TS272.7；O657.3

A

1003-0174(2017)06-0146-06