楊悠悠 劉佟 苗雨田 王浩 楊永壇

(中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院;營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209)

8種常見食用油中甘油三酯組成的分析

楊悠悠 劉佟 苗雨田 王浩 楊永壇

(中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院;營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209)

基于液相色譜-電霧式檢測(cè)器，建立了食用油中甘油三酯的分離分析方法。借助液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，鑒定出了大豆油中43種甘油三酯；并依據(jù)等碳數(shù)原則，確定了大豆油、花生油、菜籽油、玉米油等8種常見食用油中的甘油三酯組成。以乙腈和異丙醇為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式并結(jié)合電霧式檢測(cè)器進(jìn)行甘油三酯的分離分析。以α-亞麻酸甘油三酯、γ-亞麻酸甘油三酯、亞油酸甘油三酯及油酸甘油三酯等4種甘油三酯為模型化合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，4種甘油三酯在該檢測(cè)器上具有類似的響應(yīng)因子；另外，在信噪比(S/N=3)時(shí),計(jì)算得到4種甘油三酯的檢測(cè)限均為0.1 μg/mL。基于甘油三酯的面積百分比定量研究，配備電霧式檢測(cè)器的液相色譜方法能夠更準(zhǔn)確地分析甘油三酯的組成及其差異。

液相色譜-電霧式檢測(cè)器 甘油三酯 等價(jià)碳數(shù)法 食用油

食用油是人體重要的能量來(lái)源之一,其中95%以上的成分為甘油三酯。甘油三酯的骨架結(jié)構(gòu)決定了甘油三酯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，隨甘油三酯骨架上脂肪酸種類的不同營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也各異[1-2]。目前，對(duì)于食用油的真?zhèn)舞b定，多采用脂肪酸組成及相關(guān)計(jì)量學(xué)方法[3]，而甘油三酯的結(jié)構(gòu)鑒定及組成分析可為食用油的真?zhèn)舞b定提供更準(zhǔn)確、更直接的證據(jù)。因此，越來(lái)越多的油脂工作者對(duì)甘油三酯的組成和結(jié)構(gòu)定性給予了很高的關(guān)注度。甘油三酯的測(cè)定主要有氣相色譜法[4]和液相色譜法[5-6]等。使用氣相色譜進(jìn)行甘油三酯的直接分離分析時(shí)，需要使用超高溫氣相色譜柱，最高使用溫度350 ℃，對(duì)于多不飽和脂肪酸來(lái)說，容易發(fā)生熱降解[7-8]。使用液相色譜進(jìn)行甘油三酯分析時(shí)，常用的檢測(cè)器有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、質(zhì)譜儀、紫外檢測(cè)器等[1]。紫外檢測(cè)器的要求是被測(cè)物質(zhì)具有紫外或可見吸收官能團(tuán)。然而，由于食用油中甘油三酯組成復(fù)雜，不同甘油三酯所含雙鍵數(shù)目和雙鍵位置不同，因而具有不同的紫外吸收強(qiáng)度。因此，基于面積歸一化法，紫外檢測(cè)器不能進(jìn)行甘油三酯的準(zhǔn)確定量。示差折光檢測(cè)器要求不能進(jìn)行梯度洗脫，大大限制了甘油三酯的分離。另外，示差折光檢測(cè)器對(duì)環(huán)境要求高，基線較難平衡，靈敏度也相對(duì)較差。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)梯度洗脫，檢出限較示差折光檢測(cè)器可降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器與示差折光檢測(cè)器一樣，為通用型檢測(cè)器，可檢測(cè)無(wú)紫外吸收或吸收較弱的化合物如甘油三酯、糖等。近年來(lái)，質(zhì)譜檢測(cè)器憑借其強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析功能，越來(lái)越多地應(yīng)用在酯類化合物的檢測(cè)中[9-10]。然而，不同化合物的質(zhì)譜響應(yīng)差別較大，因而也無(wú)法使用面積百分比法進(jìn)行定量。電霧式檢測(cè)器 (CAD)是近些年發(fā)展起來(lái)的通用型檢測(cè)器，其檢測(cè)靈敏度較高，檢出限可小于1 μg/mL[11]，有利于目標(biāo)分析物的真?zhèn)舞b定或指紋圖譜研究。

本試驗(yàn)借助液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的結(jié)構(gòu)定性功能，依據(jù)等碳數(shù)原則，進(jìn)行食用油中甘油三酯種類的確定；基于液相色譜-電霧式檢測(cè)器聯(lián)用的檢測(cè)分析技術(shù)，研究食用油中甘油三酯組成的分析方法，并將其應(yīng)用于不同食用油中甘油三酯組成差異的比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油、大豆油、玉米油等8種常見食用油：市售；甲醇、異丙醇為色譜純：美國(guó)Thermo Fisher公司；α-亞麻酸甘油三酯、γ-亞麻酸甘油三酯、亞油酸甘油三酯和油酸甘油三酯(純度均大于99%)：美國(guó)Nu-Chek公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

U3000液相色譜儀(配備Corona Veo RS電霧式檢測(cè)器)：美國(guó)Thermo Fisher公司；XS105十萬(wàn)分之一天平：美國(guó)梅特勒-托利多公司；30A液相色譜儀：日本島津公司；5500 QTrap質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取約10 mg的食用油，溶于10 mL異丙醇，渦旋混合均勻，待液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.3.2 液相色譜-電霧式檢測(cè)器條件

使用waters Xselect HSS T3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 液相色譜柱，以乙腈(A)/異丙醇(B)為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。流動(dòng)相梯度洗脫條件為：0 min，0% B；5 min，0% B；25 min，20% B；70 min，40% B；75 min，80% B；75.1 min，0% B；85 min，0% B。電霧式檢測(cè)器條件：霧化溫度 35 ℃，采集頻率 10 Hz。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

使用Waters Xselect HSS T3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 液相色譜柱，以乙腈/10 mmol/L甲酸銨水溶液 (98∶2, A) 和異丙醇/10 mmol/L甲酸銨水溶液 (98∶2, B)流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。流動(dòng)相梯度洗脫條件為：0 min，0% B；5 min，0% B；25 min，20% B；70 min，40% B；75 min，80% B；75.1 min，0% B；85 min，0% B。質(zhì)譜離子源條件：ESI(+)；氣簾氣 20 psi；氣體1 55 psi；氣體2 55 psi；噴霧電壓：5 500 V；去簇電壓：100 V。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

以大豆油為例，基于液相色譜-質(zhì)譜的定性功能，對(duì)各色譜峰進(jìn)行定性，依據(jù)等價(jià)碳數(shù)原則 (ECN)，即ECN=碳原子數(shù)-2倍雙鍵數(shù)目，計(jì)算各色譜峰所代表化合物的ECN。使用面積百分比法，依據(jù)液相色譜-電霧式檢測(cè)法所得峰面積計(jì)算各ECN值的甘油三酯的百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 電霧式檢測(cè)器測(cè)定甘油三酯的性能評(píng)價(jià)

目前，甘油三酯組成的定量評(píng)價(jià)多數(shù)基于面積百分比法，為準(zhǔn)確測(cè)定甘油三酯的百分含量，應(yīng)盡量選擇響應(yīng)因子一致的檢測(cè)器。在最優(yōu)化分離分析條件下，如圖1所示，4種模型化合物α-亞麻酸甘油三酯、γ-亞麻酸甘油三酯、亞油酸甘油三酯及油酸甘油三酯的響應(yīng)因子幾乎相同，見表1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為2.10%。相對(duì)于基于傳統(tǒng)紫外檢測(cè)的面積百分比定量來(lái)說，電霧式檢測(cè)具有更高的準(zhǔn)確度。

注：1為α-亞麻酸甘油三酯，2為γ-亞麻酸甘油三酯，3為亞油酸甘油三酯，4為油酸甘油三酯。圖1 不同甘油三酯LC/CAD譜圖

食用油的真?zhèn)舞b別或指紋圖譜分析中，低含量甘油三酯是主要關(guān)注點(diǎn)，是食用油的潛在標(biāo)志物，因此，高靈敏度是油脂真?zhèn)舞b定分析所追求的目標(biāo)。如表1所示，電霧式檢測(cè)器在甘油三酯分析中具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，檢出限可達(dá)0.1 μg/mL，檢出限較紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分別低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，電霧式檢測(cè)器分析甘油三酯也具有極好的重復(fù)性，信號(hào)響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。因此，電霧式檢測(cè)器在食用油甘油三酯組成分析中更具有優(yōu)勢(shì)。

表1 4種甘油三酯的響應(yīng)因子、檢出限及峰面積RSD

2.2 液相色譜分離分析食用油甘油三酯組成

基于電霧式檢測(cè)器，本研究采用非水反相液相色譜法分析食用油中甘油三酯。通過優(yōu)化流動(dòng)相比例，以達(dá)到甘油三酯的最佳分離，盡量減少甘油三酯的共流出，如圖2所示。然而，由于食用油中甘油三酯種類眾多，可達(dá)到數(shù)百種，憑借一維液相色譜的單一分離機(jī)理和分離能力，無(wú)法實(shí)現(xiàn)所有甘油三酯的基線分離。等價(jià)碳原子數(shù)(ECN)規(guī)則的引入，可以有效降低甘油三酯定性的難度及增加甘油三酯定量的準(zhǔn)確度，并能很好地應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室甘油三酯的常規(guī)測(cè)試中。因此，等價(jià)碳原子數(shù)的確定為關(guān)鍵點(diǎn)。以大豆油為模型，采用LC/MS對(duì)大豆油中的甘油三酯進(jìn)行定性，并計(jì)算相應(yīng)的ECN值，如表2所示。通過ECN規(guī)則，可將LC-MS鑒定出的43種甘油三酯分為ECN38、ECN40、ECN42、ECN44、ECN46、ECN48、ECN50、ECN52、ECN54，大類甘油三酯。另外，由表2所知，在非水反相液相色譜中，甘油三酯的出峰順序按照ECN從小到大順序洗脫。因此，根據(jù)甘油三酯響應(yīng)對(duì)保留時(shí)間的色譜圖，可確認(rèn)甘油三酯響應(yīng)對(duì)ECN的色譜圖，如圖2所示，并可以將其拓寬至其他種類食用油甘油三酯組成分析中，而無(wú)需重新對(duì)甘油三酯進(jìn)行LC-MS確認(rèn)。

表2 由LC-MS鑒定出的大豆油中甘油三酯的類型

圖2 大豆油的LC-CAD色譜圖

2.3 不同食用油中甘油三酯的組成分析

在最優(yōu)化條件下，基于ECN規(guī)則，測(cè)定大豆油、花生油、菜籽油等8種常見食用油中甘油三酯的組成，其中，ECN=38、40、42、44、46、48、50、52、54為最主要的甘油三酯，不同食用油中，各甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表3所示。其中，葵花籽油和花生油不含有甘油三酯ECN38和ECN40，可作為區(qū)分葵花籽油、花生油與大豆油、菜籽油和葡萄油的關(guān)鍵指標(biāo)；除此之外，花生油中ECN42甘油三酯含量較其他食用油中ECN42含量小，可作為花生油的另一差異性指標(biāo)；另外，玉米油中甘油三酯ECN50與其他食用油存在顯著差異，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1.0%；橄欖油較特殊，所含甘油三酯ECN的范圍較窄，僅含有ECN=44、46、48、50、52，不含有ECN=38、40、42的甘油三酯，另外，ECN=44的甘油三酯較其他食用油含量小得多，僅為2.97%，因此，對(duì)于橄欖油的摻假則可以依據(jù)ECN=38、40、42、44等甘油三酯的含量。

表3 8種食用油中甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

3 結(jié)論

基于液相色譜-電霧式檢測(cè)器，建立了花生油、玉米油等8種常見食用油中甘油三酯組成的分析方法。與液相色譜紫外檢測(cè)法或液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法相比，該方法具有更高的靈敏度，可更好地應(yīng)用于低含量甘油三酯的檢測(cè)分析中。另外，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜法鑒定出大豆油中43種甘油三酯，通過引入等碳數(shù)規(guī)則，進(jìn)行了不同食用油中甘油三酯的歸類并測(cè)定了其百分比組成。該方法由于高靈敏度及不同甘油三酯的響應(yīng)一致性，可應(yīng)用于花生油、玉米油、葵花籽油、橄欖油等不同食用油的差異化研究，以期應(yīng)用于食用植物油的真?zhèn)舞b別中。

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Composition Analysis of Triacylglycerols in Eight Common Edible Oils

Yang Youyou Liu Tong Miao YuTian Wang Hao Yang Yongtan

(COFCO Nutrition & Health Research Institute；Beijing Key Laboratory of Nutrition Health and Food Safety, Beijing 102209)

Triacylglycerols in edible oils were separated and analyzed using liquid chromatography with charged aerosol detector. With liquid chromatography/mass spectrometry, 43 triacylglycerols were identified in soybean oil. According to their equivalent carbon number, the composition of triacyglycerols in common edible oils such as soybean oil, peanut oil, canola oil, maize oil and so on were determined. Using acetonitrile and isopropanol as the mobile phase, the triacylglycerols were separated with gradient elution. Glyceryl tri-α-linolenate, glyceryl tri-γ-linolenate, Glyceryl tri linoleate, glyceryl trioleate were used as the model triacylglycerols. It was showed that the response factors of those four triacylglycerols were similar. And under the optimized conditions, the detection limits of those four triacylglycerols were 0.1 μg/mL. Therefore, with the quantification methods of area normalization, the developed analyzing methods using liquid chromatography/charged aerosol detector could provide the accurate composition of triacylglycerols, which could facilitate the differential analysis.

liquid chromatography with charged aerosol detector, triacylglycerol, equivalent carbon number, edible oils

中糧集團(tuán)項(xiàng)目(2013-C2-F007)

2015-10-20

楊悠悠，女，1984年出生，高級(jí)工程師，食品質(zhì)量與安全檢測(cè)

楊永壇，男，1971年出生，研究員，食品質(zhì)量與安全

TS225

A

1003-0174(2017)05-0122-05