洪凰++朱洪亮++葛芳芳

摘要 建立了高效液相色譜法測(cè)定了肉制品中N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）和N-亞硝基吡咯烷（NPIR）化合物的新方法。通過(guò)與脫亞硝基化試劑（HBr+HAc）作用，脫去亞硝基生成相應(yīng)的二級(jí)胺，再與丹磺酰氯反應(yīng)，熒光檢測(cè)器（FLD）檢測(cè)，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：該方法在0.1～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，3種化合物均具有良好的線性響應(yīng)，方法對(duì)NDMA、NDEA、NPIR的檢出限均為0.5、2.0、2.0 μg/kg，在不同添加水平下的平均回收率分別在86.7%～116.4%、81.0%～91.5%、82.5%～107.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<8.9%。

關(guān)鍵詞 柱前衍生；高效液相色譜法；亞硝胺

中圖分類號(hào) O675 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）16-0243-01

亞硝胺是對(duì)含有N-N=O化合物的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱，其具有較強(qiáng)的致癌性。亞硝胺類化合物的數(shù)量很大，而且多數(shù)亞硝胺化合物的致癌性都很強(qiáng)。現(xiàn)有研究表明，已經(jīng)檢測(cè)到的亞硝胺類化合物種類有300多種，有270種以上能夠誘導(dǎo)至少1種動(dòng)物癌癥。食品中發(fā)現(xiàn)的亞硝胺主要為N-二甲基亞硝胺、N-二乙基亞硝胺、亞硝胺吡咯烷等。

目前，針對(duì)《食品中N-亞硝胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5009.26-2003）》中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為氣相色譜-熱能分析儀法和氣相色譜-高分辨率質(zhì)譜法。但氣相色譜-熱能分析儀法需要專用的熱能檢測(cè)器，高分辨率質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室較少配備。液相色譜法檢測(cè)食品中亞硝胺雖有報(bào)道[1-2]，但由于在紫外光的照射下會(huì)發(fā)生分解，造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。但液相色譜具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室都配備。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，尋找一種應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定食品中亞硝胺污染物的方法十分必要。本文通過(guò)丹磺酰氯衍生反應(yīng)改變N-亞硝胺的結(jié)構(gòu)，提高液相色譜對(duì) N-亞硝胺的選擇性和靈敏度，建立了一套基于柱前衍生高效液相色譜測(cè)定肉制品中種亞硝胺的新方法，方法簡(jiǎn)單，適用性強(qiáng)，解決了各級(jí)食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室由于檢測(cè)設(shè)備的限制而無(wú)法對(duì)這一類食品中的重要污染物進(jìn)行監(jiān)測(cè)的難題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-二乙基亞硝胺（NDEA）、亞硝胺吡咯烷（NPIR）標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

丹磺酰氯衍生試劑的配制：稱取丹磺酰氯試劑1.00 g，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中。

脫亞硝基化試劑的配制：準(zhǔn)確移取48% HBrO3 1.0 mL到10 mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋到刻度。

二氯甲烷、乙腈、正己烷均為色譜純；其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

SPE柱的預(yù)處理：在6 mL SPE柱中裝填A(yù)mbersorb 572填料1 500 mg，填料上下各墊一層玻璃棉，依次用正己烷10 mL、二氯甲烷10 mL淋洗，抽干殘留溶劑后再用純水10 mL潤(rùn)洗，備用。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ODS-2 Hypersil C18柱（200×4.6 mm，5μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積50 μL；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相為乙腈-水（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)生波長(zhǎng)530 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎的樣品200.0 g于500 mL水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾燒瓶中，加入水100 mL及氯化鈉120 g，充分振搖使氯化鈉完全溶解，連接蒸餾裝置，收集餾出液400 mL。餾出液過(guò)SPE柱，保持流速為6 mL/min[3]。

572柱萃取完成后，35 kPa負(fù)壓下抽干去除殘余水分， 用二氯甲烷7 mL將亞硝胺化合物洗脫下來(lái)。將洗脫液再過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱脫水后，用氮吹儀于40 ℃下濃縮至約100 μL。將上述濃縮液轉(zhuǎn)移到1.5 mL反應(yīng)瓶中， 加入脫亞硝基化試劑20 μL，密封后置于100 ℃控溫箱中進(jìn)行脫亞硝基化反應(yīng)10 min。冷卻至室溫后，加入2 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，使之呈堿性，然后加入飽和碳酸氫鈉溶液300 μL進(jìn)行緩沖，再加入丹酰氯溶液100 μL，蓋塞混勻后，于40 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)避光反應(yīng)45 min。反應(yīng)完畢后，用乙腈定容至5 mL，振蕩混勻后，取適量溶液，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫亞硝基化反應(yīng)

要將N-亞硝胺化合物結(jié)構(gòu)中的N-NO鍵斷開(kāi)，需要脫亞硝基試劑（氫溴酸和冰醋酸的混合物），反應(yīng)發(fā)生后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的二級(jí)胺和NO自由基。根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，在100 ℃下反應(yīng)10 min可得到滿意的結(jié)果，因此試驗(yàn)選取100 ℃和10 min作為脫亞硝基化反應(yīng)的溫度和時(shí)間。

2.2 衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同的衍生化反應(yīng)物和反應(yīng)條件對(duì)衍生化反應(yīng)具有重要的影響。將N-二乙基亞硝胺的脫亞硝基化產(chǎn)物、二乙胺（DMA）應(yīng)用在試驗(yàn)中，確定另一種反應(yīng)物為丹磺酰氯，在不同的反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定衍生化反應(yīng)的條件。

2.2.1 反應(yīng)溫度的選擇。為了明確反應(yīng)溫度對(duì)試驗(yàn)效果的影響，進(jìn)行了不同溫度下的衍生化反應(yīng)試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置的溫度為20、30、40、60、80 ℃，反應(yīng)物為二乙胺與丹磺酰氯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高溫度有利于提高衍生化反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)在 40 ℃時(shí)衍生物含量最大，繼續(xù)升高溫度對(duì)衍生物的生成量影響不大，甚至反而下降，這可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致其他副反應(yīng)的產(chǎn)生，故選擇40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，丹磺酰氯與生物多胺的反應(yīng)在放置過(guò)夜或在較短時(shí)間內(nèi)適當(dāng)加熱均能反應(yīng)完全，本文固定其他條件，測(cè)定在40 ℃時(shí)，二乙胺與丹磺酰氯在20～60 min內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)在40 min后衍生化產(chǎn)物的生成量基本穩(wěn)定，故本試驗(yàn)選定45 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.2.3 pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響。研究表明[5]，弱堿性的反應(yīng)環(huán)境能夠使丹磺酰氯衍生反應(yīng)獲得較好的效果，而溶液的酸堿性會(huì)隨著N-亞硝胺脫亞硝基化反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸改變，在試驗(yàn)結(jié)束后，溶液呈強(qiáng)酸性，要選擇強(qiáng)堿對(duì)其進(jìn)行中和。本試驗(yàn)過(guò)程中選擇的強(qiáng)堿試劑為NaOH溶液，試劑的濃度為2 mol/L，由此來(lái)改變?nèi)芤旱膒H值，再加入300 μL飽和NaHCO3組成緩沖溶液，以考察溶液pH值對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明加入100 μL的2 mol/L NaOH溶液時(shí)的產(chǎn)率最高[6-10]。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了乙腈-水和甲醇-水2種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，乙腈比甲醇的洗脫能力強(qiáng)，有更好的分離能力，使用甲醇作流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物不僅保留時(shí)間長(zhǎng)而且峰型較寬，試驗(yàn)選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，當(dāng)乙腈：水的比例為55∶45時(shí)，3種化合物峰型良好，且相互之間能夠很好的分離。優(yōu)化后的標(biāo)樣分離圖譜見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

將試驗(yàn)儀器按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)置，測(cè)定和繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的過(guò)程中以濃度X（μg/L）、峰面積（Y）分別作為橫縱坐標(biāo)。結(jié)果表明，在0.5～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)，3種亞硝胺化合物線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.995以上，檢出限均在0.2 μg/kg（表1）。

2.5 方法回收率與精密度

在某腌豬肉樣品中分別加入3種亞硝胺化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其中亞硝胺的含量分別為2.0、20.0 μg/kg，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足分析得要求。

3 結(jié)論

本文建立了通過(guò)柱前衍生以高效液相色譜熒光檢測(cè)的方法分析食品中N-亞硝二甲胺、N-亞硝二乙胺、N-亞硝吡咯烷污染物的新方法，該方法的線性范圍及回收率均能滿足分析的要求，可用于肉制品中亞硝胺污染物的檢測(cè)分析。

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