傅暉+顧菁

摘 要 目的：提高腺病毒制品的穩(wěn)定性。方法：采用冷凍干燥技術(shù)制備腺病毒凍干制劑。結(jié)果：腺病毒凍干制品在 4 ℃放置12個(gè)月，活性（病毒滴度）下降不超過10%。結(jié)論：改進(jìn)后的腺病毒凍干制劑在臨床上作為基因治療的載體有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 腺病毒 冷凍干燥 穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：R944 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）13-0067-03

Preliminary research for the preparation of adenovirus lyophilized reagent

FU Hui*， GU Jing

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT Objective： To improve the stability of adenovirus in lyophilized reagent. Methods： Adenovirus reagent was lyophilized by freeze-drying method. Results： The activity of adenovirus was decreased less than 10% in lyophilized reagent after it was stored at 4 ℃ for 12 months. Conclusion： The improved adenovirus lyophilized reagent possesses better application prospects in clinic as a vector for gene therapy.

KEY WORDS adenovirus； freeze-drying； stability

隨著基因治療研究的逐漸深入，作為其基礎(chǔ)的病毒載體研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。采用病毒載體的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)治療人類疾病不僅在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究，而且已進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段[1]。腺病毒因其對(duì)人致病性小且不誘導(dǎo)癌變，宿主細(xì)胞廣，繁殖滴度高，裝載容量大，而成為近年來病毒載體研究熱點(diǎn)[2-3]。但是腺病毒制品對(duì)溫度較為敏感，給運(yùn)輸、保存帶來較大困難，這在很大程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用[4]。作為一種傳統(tǒng)技術(shù)，冷凍干燥廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、疫苗等[5-8]，采用此技術(shù)可較好地保持產(chǎn)品原有的理化性質(zhì)和生物活性，且有效成分損失極少，產(chǎn)品因含水量低而易于長(zhǎng)期保存。近年來，國(guó)外陸續(xù)出現(xiàn)將冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用到病毒疫苗及腺病毒制劑研究中的報(bào)道[9-11]。目前腺病毒的保存條件為PBS緩沖液于-20 ℃以下保存，經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)，在這種條件下的腺病毒在25 ℃保存8 h及4 ℃保存24 h活性均下降10倍左右，而且反復(fù)凍融也會(huì)大大降低它的病毒滴度。為此我們做了冷凍干燥的條件改進(jìn)研究，以便更好地方便臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

蔗糖（分析純，Sigma公司）；甘露醇注射液（藥用輔料，浙江東華生物科技有限公司）；明膠（BR，上海明膠廠）；L-半胱氨酸（原料藥，成都嘉葉生物科技有限公司）；人血白蛋白（萊氏血制品公司）。

LYO-0.5冷凍真空干燥機(jī)（上海東富龍科技股份有限公司）；UV1800紫外分光光度計(jì)（島津公司）；XSP200生物顯微鏡（深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

采用傳統(tǒng)冷凍干燥方法，先將制品在-40 ℃條件下預(yù)凍至-35 ℃，真空度為2.3 Pa，每 2 h溫度上升 5 ℃，至 28 ℃左右保持 3 h。凍干保護(hù)劑組分為：4%明膠、5%甘露醇、20%人血白蛋白及蔗糖，本研究通過改變凍干保護(hù)劑中蔗糖濃度（1%、3%、5%）制備成不同的腺病毒樣品冷凍干燥，比較凍干前后腺病毒顆粒數(shù)及活性變化，從而選擇理想的凍干保護(hù)劑。

1.3 穩(wěn)定性研究

該腺病毒凍干制品保存條件為-20 ℃以下，為了研究?jī)龈芍苿┡c我們現(xiàn)有工藝（水針劑-20 ℃保存）的質(zhì)量比較，我們選擇了加速實(shí)驗(yàn)，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版“穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則”，我們選擇了一個(gè)高溫實(shí)驗(yàn)（人體溫度37 ℃），另一個(gè)選擇了上述指導(dǎo)原則規(guī)定的低溫保存藥品的加速試驗(yàn)溫度（4 ℃），具體穩(wěn)定性研究方案如下：

將腺病毒凍干制品置于37 ℃貯藏1～7 d，比較其活性變化。

將腺病毒凍干制品置于4 ℃，貯藏1、2、3、6和12個(gè)月，比較其活性變化。

1.4 活性檢測(cè)方法

用TCID50方法檢測(cè)活性：根據(jù)病毒顆粒數(shù)稀釋樣品，在96 孔板上每孔加入100 ml各梯度稀釋液，每個(gè)梯度重復(fù)8孔，另留8孔作為空白對(duì)照，然后每孔加入293細(xì)胞懸液100 ml，細(xì)胞密度：5.0×105個(gè)/ml。置37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d，用Karber法計(jì)算病毒滴度，計(jì)算公式為：lgTCID50=L-D（S-0.5） 。式中L為最高稀釋度的對(duì)數(shù)；D為稀釋度對(duì)數(shù)之間的差；S為陽性孔比率總和。

用OD260法檢測(cè)病毒顆粒數(shù)。樣品中加入裂解液，以紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm吸光度值。依公式：腺病毒顆粒/ml=A值×稀釋倍數(shù)×1012計(jì)算腺病毒顆粒數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 凍干可行性研究

通過改變凍干保護(hù)劑的糖濃度對(duì)凍干制品的影響發(fā)現(xiàn)（表1），當(dāng)凍干保護(hù)劑中蔗糖濃度為3%時(shí)，既能保證腺病毒凍干制品水分合格，又能保證其病毒顆粒數(shù)及活性處于較高的狀態(tài)，并經(jīng)3次凍干實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)凍干前后制品活性變化較?。ū?），認(rèn)為腺病毒凍干制品的研究是有可行的。

2.2 穩(wěn)定性研究

對(duì)3批腺病毒凍干制品進(jìn)行37 ℃高溫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在37 ℃放置7 d，活性下降不超過10%。4 ℃加速實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在4 ℃放置12 個(gè)月，活性下降也不超過10%（圖1）。

3 討論

腺病毒的外殼由 252 個(gè)亞單位組成，腺病毒的亞單位在凍干時(shí)需維持其本身結(jié)構(gòu)才能有效保持其活性[12-13]。影響腺病毒凍干保存效果的因素很多，例如保護(hù)劑、凍干過程參數(shù)（預(yù)凍溫度、降溫速率、干燥溫度和真空度等），相比之下，保護(hù)劑對(duì)凍干保存效果的影響最為突出。

冷凍干燥會(huì)使腺病毒經(jīng)歷低溫和脫水兩個(gè)激烈的物理變化過程，對(duì)腺病毒造成大規(guī)模損傷，最終導(dǎo)致病毒死亡或者影響生物功能的正常發(fā)揮，因此用冷凍干燥法保存腺病毒必須添加合適的保護(hù)劑。通過對(duì)自然界無水生命在低溫和干燥環(huán)境下存活機(jī)理的研究，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)糖類，特別是雙糖由于具有替代水分子以及形成玻璃態(tài)的能力[14-15]，在凍結(jié)和干燥過程中對(duì)微生物有很好的保護(hù)作用，是非常有效的保護(hù)劑。本研究選擇一種雙糖（蔗糖）作為保護(hù)劑，比較糖濃度對(duì)腺病毒凍干保存的保護(hù)效果。

有研究結(jié)果表明凍干制品的穩(wěn)定性與其水分密切相關(guān)[16]，只有將腺病毒凍干制品的水分控制在中國(guó)藥典2015年版三部規(guī)定的范圍內(nèi)，才能保證其穩(wěn)定性，而蔗糖的濃度對(duì)于腺病毒凍干制品水分的控制是至關(guān)重要的，蔗糖濃度低，不能保證腺病毒凍干制品的活性，蔗糖濃度高，凍干制品的水分又難以控制。因此保護(hù)劑中選擇一個(gè)合適的蔗糖濃度，對(duì)腺病毒凍干制品水分控制極為重要。本研究用三種不同的蔗糖濃度作為凍干保護(hù)劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)蔗糖含量在3%時(shí)對(duì)腺病毒活性的影響最小，而且用3%蔗糖濃度作為保護(hù)劑的腺病毒凍干制品，在37 ℃及4 ℃穩(wěn)定性較好。近兩年有使用混合糖類作為血小板凍干制品的保護(hù)劑研究[17]，但混合糖作為腺病毒凍干的保護(hù)劑效果還有待繼續(xù)研究。

另外，凍干條件對(duì)于水分的控制也比較重要。凍干過程一般包括預(yù)凍、升華干燥（第一階段干燥）、解吸干燥（第二階段干燥）。在研究腺病毒的凍干條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)預(yù)凍十分重要[8]，在預(yù)凍階段，降溫速度越快越好，這主要還是由凍干機(jī)的降溫性能決定的，而在此階段中，要掌握適宜的預(yù)凍時(shí)間，以確保抽真空前所有的產(chǎn)品均已凍實(shí)，這樣就不致因抽真空而噴瓶，并且能減少“粗結(jié)晶”（的出現(xiàn)，最終利于水分的控制。而在升華干燥階段，最關(guān)鍵的是要考慮在適宜的時(shí)間內(nèi)使制品干燥成型，那就必須獲得最適宜的熱量以確保腺病毒制品的升華，這與真空度密切相關(guān)[18]。真空度<10 Pa，并在升華干燥階段將制品溫度維持在5 ℃為最好。在解吸干燥階段，主要是去除產(chǎn)品的結(jié)合水分，應(yīng)盡量將產(chǎn)品溫度迅速上升到設(shè)定的最高溫度，溫度過低，不能控制水分，溫度過高，對(duì)于腺病毒來說，又有失活的可能，在此階段將制品溫度維持在 28 ℃左右是最佳的。

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