1株華木蓮內(nèi)生真菌的抗氧化活性分析和菌株鑒定

劉紫英 袁斌 冷桂華

摘要：華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）為木蘭科中我國特有的單種屬植物，全世界唯宜春特有的珍稀瀕危新樹種，對從華木蓮葉片中分離的多株內(nèi)生真菌進(jìn)行抗氧化活性分析，篩選出抗氧化性較高的菌株并鑒定。篩選華木蓮葉片的內(nèi)生真菌，制備其發(fā)酵液提取物，采用TBA反應(yīng)法、超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羥基自由基（·OH）清除能力的分析測定其抗氧化活性，對抗氧化活性高的內(nèi)生真菌菌株利用試劑盒提取內(nèi)生真菌總DNA，擴(kuò)增其rDNA的ITS序列并測序。結(jié)果顯示，菌株SL-3的總抗氧化活性很高，比對照、以維生素C為底物的高。通過對抗氧化活性成分的分析可知，該菌株含有黃酮類化合物。對菌株SL-3進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，確定為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。說明內(nèi)生真菌SL-3產(chǎn)黃青霉具有明顯和穩(wěn)定的抗氧化活性，可用于抗氧化活性成分發(fā)酵生產(chǎn)的微生物資源。

關(guān)鍵詞：華木蓮；內(nèi)生真菌；抗氧化活性；ITS序列；黃酮類化合物；菌株鑒定；產(chǎn)黃青霉；微生物資源

中圖分類號： S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0213-04

華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）別稱落葉木蓮，為我國特有單種屬植物，屬于木蘭科，已被列為國家Ⅰ級重點保護(hù)植物，全球僅狹域分布于江西省宜春市，是特有的珍稀樹種。目前，國內(nèi)外僅施建敏等對華木蓮葉黃酮類化合物和多糖的抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，華木蓮葉內(nèi)黃酮類化合物和多糖的抗氧化性效果很好[1-2]，華木蓮具有潛在的利用價值，可成為抗衰老保健品輔料或功能因子[3]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與其宿主體內(nèi)相同或相似的生理活性成分，植物內(nèi)生菌是分離新的天然活性成分和開發(fā)新藥的潛在資源，成為當(dāng)今的研究熱點[4-5]。筆者前期已研究過華木蓮葉中內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)[6]，分離并鑒定74株華木蓮葉內(nèi)生真菌?，F(xiàn)以華木蓮的內(nèi)生真菌為研究對象，通過對多株內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵振蕩培養(yǎng)，利用硫巴比妥酸（TBA）反應(yīng)法、超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羥基自由基（·OH）清除能力研究其培養(yǎng)液提取物具有抗氧化活性，篩選出抗氧化活性成分的內(nèi)生真菌并鑒定其種屬。

1材料與方法

1.1試驗材料

華木蓮取材于江西省宜春市明月山風(fēng)景區(qū)周邊林木種植場所，分別取新鮮健康植株的葉片，組織分離法分離內(nèi)生真菌，菌株存于宜春學(xué)院江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室微生物藥物實驗室，分別編號為SL-1、SL-2、SL-3、SL-22、SL-56、SL-68。

1.2培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)液成分包括NaNO3 2.0 g、K2HPO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30 g，水 1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.3儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)（TGL-16G型）、紫外可見分光光度計 SFZ-UV-2000型（龍尼柯儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國華電器有限公司）、EHG-B恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（江蘇億通電子有限公司）、PHSJ-4A精密酸度計（上海雷磁分析儀器廠）、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海嘉鵬科技有限公司）、大龍移液器手動單道可調(diào)移液槍100～1 000 μL（芬蘭Dragonmed公司）、SHZ-III/SHZ-IIID循環(huán)水真空泵（上海京工實業(yè)有限公司）。

1.4樣品與試劑

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（10270-200901，中國藥品生物制品檢定所）、硫巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸、正丁醇、抗壞血酸、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、七水硫酸鎂、硫酸鐵、精制花生油、鄰苯三酚、水楊酸鈉、過氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醚等，以上試劑均為分析純。

1.5試驗方法

1.5.1菌株活化并擴(kuò)大培養(yǎng)從實驗室保存的菌種中挑取少量接種于察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，用打孔器在平板上取長勢較好的培養(yǎng)菌絲并接種，用于擴(kuò)大培養(yǎng)。在 250 mL 三角瓶中裝100 mL察氏液體培養(yǎng)基，用12層紗布包好都放入滅菌鍋中滅菌20 min，于28 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d。

1.5.2發(fā)酵液提取物的制備將培養(yǎng)液進(jìn)行抽濾除去菌絲和菌絲球，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，將100 mL的培養(yǎng)液濃縮至3～4 mL，加入足量無水乙醇振蕩，提取，于 5 000 r/min 下離心15 min，棄沉淀，留上清液。將上述提取液用無水乙醇定容至25 mL。

1.5.3TBA反應(yīng)法測定培養(yǎng)液提取物抗氧化活性[7]采用的TBA反應(yīng)法略有改動，配制2.5%精制花生油乙醇溶液作為底物，在各個比色管中分別加入0.02%蕓香苷、抗壞血酸和菌株培養(yǎng)液提取物（以上均采取底物4 mL、反應(yīng)6 mL進(jìn)行反應(yīng)），混勻后于37 ℃水浴中存放；每24 h取出1 mL待測液樣品，加入1 mL 25%三氯乙酸，混勻，放置5 min，然后加入 1 mL 0.67% TBA，于沸水中加熱20 min；取出，冷卻，再加入 4 mL 正丁醇，劇烈振蕩，于4 000 r/min下離心10 min，取上層正丁醇液，于532 nm波長處比色；以蒸餾水代替抗氧化劑的空白樣品作為對照，存放24、48、72、96、120、144 h后測D532 nm值。

1.5.4超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除能力的測定[8]

采用鄰苯三酚自氧化進(jìn)行測定，取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.2），4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃水浴中預(yù)熱過的 3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻，倒入比色杯，325 nm下每隔30 s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)1 min內(nèi)吸光度的增加量，以 10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。按照上述方法步驟加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL不同的樣品液，同樣10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照，同樣方法測定吸光度。前后2次的樣品吸光度差（ΔD）與測定時間差（ΔT）的比值即為該時段的鄰苯三酚自氧化速率。

[JZ]清除能力率=（ΔD1/ΔT-ΔD2/ΔT）/ΔD1/ΔT×100%。

式中：ΔD1/ΔT代表鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率；ΔD2/ΔT代表加入樣品液后鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率。

1.5.5樣品對羥基自由基（·OH）的清除率[9]

采用水楊酸比色法進(jìn)行測定，在4 mL反應(yīng)液（含0.15 mol/L硫酸亞鐵1 mL、6 mmol/L水楊酸鈉1 mL）中加入不同濃度的樣品 1 mL，再加入雙氧水啟動反應(yīng)；37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，測定 510 nm 處的吸光度，吸光度越大，則清除羥基自由基效果越好。

[JZ]·OH清除率=[D0-（Di-D0i）]/D0×100%。

式中：D0代表用蒸餾水代替樣品的的對照值；Di代表加樣品后的吸光度；D0i代表樣品本底吸光度。

1.5.6蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和發(fā)酵液中黃酮類化合物濃度的測定[10]

1.5.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取0.001 5 g蕓香苷標(biāo)樣，溶于15 mL的30%乙醇溶液中，分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 此溶液于10 mL比色管中，各補(bǔ)加30%乙醇溶液使成5 mL體積。加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加100 mg/L硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，靜置 15～20 min后，于510 nm處測定吸光度D。

1.5.6.2樣品濃度的測定分別取6個不同編號的10 mL比色管，裝入樣品各5 mL，依次加入50 mg/L亞硝酸鈉 0.3 mL，靜置6 min；加100 mg/L硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，靜置15～20 min，同時以30%乙醇溶液代替樣品液配制空白試劑，在510 nm處測定吸光度D。

1.5.7抗氧化活性高的內(nèi)生真菌菌株的分子鑒定

用生工生物工程上海（股份）有限公司的真菌基因組DNA提取試劑盒和PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增、ITS（internal transcribed spacer）序列分析，即根據(jù)已知真菌的保守序列設(shè)計1對特異性引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化目的片段，純化產(chǎn)物由生工生物工程上海（股份）有限公司測序。以NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastn程序比對分析，使利用MEGA 6.0軟件和鄰接法（neighbour-joining methods）進(jìn)行聚類分析鑒定種屬。

2結(jié)果與分析

2.1TBA反應(yīng)法測華木蓮內(nèi)生真菌抗氧化活性

以2.5%精制花生油乙醇溶液作為底物進(jìn)行反應(yīng)，其結(jié)果見表1。清除率=（對照的D532 nm-樣品的D532 nm）/對照的D532 nm×100%。由表1可知，D532 nm值越小，抗氧化活性越高。隨時間的延長，該6株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液提取物與各抗氧化劑均不同程度抑制了花生油的脂質(zhì)過氧化。培養(yǎng)144 h時停止該試驗，數(shù)據(jù)顯示抑制作用還很明顯，其樣品清除率從大到小依次為SL-3>SL-68>SL-22>維生素C>SL-1=蕓香苷>SL-2>SL-56，由此可見菌株SL-3、SL-68、SL-22可以較顯著地延緩花生油的脂質(zhì)過氧化過程，具有相對較強(qiáng)的抗氧化能力，值得進(jìn)一步研究。

2.3華木蓮內(nèi)生真菌發(fā)酵液對羥基自由基的清除率

從表3可知，華木蓮內(nèi)生真菌發(fā)酵液對羥基自由基的清除率從大到小依次為SL-3>SL-68>SL-22>SL-2>SL-56>SL-1，相對于超氧陰離子自由基的清除率普遍較高。內(nèi)生真菌SL-3、SL-68、SL-22對羥基自由基的清除率都比較高，其中SL-3的清除率為64.03%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株，顯示出很高的抗氧化性。

2.4內(nèi)生真菌培養(yǎng)液的抗氧化物質(zhì)中黃酮類化合物濃度

由不同濃度蕓香苷繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），根據(jù)該曲線得到標(biāo)準(zhǔn)方程：y=0.018 9x-0.046 2，r2=0.963 3。式中，x代表蕓香苷濃度；y代表吸光度。

同樣有6種樣品在510 nm處的吸光度以及代入式中得到[CM（25]的抗氧化物質(zhì)的濃度見表4。從表4可以看出，SL-3、

綜上可知，內(nèi)生真菌SL-3的TBA可以較顯著地延緩脂質(zhì)過氧化過程，具有相對較強(qiáng)的抗氧化能力，對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率效果很好；SL-3含黃酮類抗氧化物質(zhì)濃度較高，為34.338 μg/mL，是抗氧化性物質(zhì)高產(chǎn)菌株，因而對其進(jìn)行種屬鑒定。

2.5華木蓮內(nèi)生真菌SL-3種屬鑒定

華木蓮內(nèi)生真菌SL-3形態(tài)學(xué)鑒定的方法參見筆者前期的華木蓮葉中內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)研究[6]，其形態(tài)學(xué)特點為

典型的青霉屬真菌，現(xiàn)對其進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)擴(kuò)增5.8S rDNA序列，并測序內(nèi)生真菌SL-3的ITS區(qū)含548 bp，通過GenBank中進(jìn)行Blast比對，應(yīng)用MEGA 6.0軟件中鄰接法（neighbour-joining methods，NJ）構(gòu)建聚類分析樹狀圖，bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復(fù)?；?0個菌株ITS序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確證SL-3菌株的分類歸屬（圖2），由此可以看出與內(nèi)生真菌SL-3處于同一分支的4株菌株均為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum），并且這個菌株與產(chǎn)黃青霉的ITS序列相似性達(dá)99%。Renske等認(rèn)為， 通過ITS區(qū)域比對，序列相似性≥99%，鑒別為相同種，即內(nèi)生真菌 SL-3 鑒定為產(chǎn)黃青霉[11]。

3結(jié)論

目前，尋找外源性自由基清除劑和抗氧化劑來延緩衰老，已經(jīng)成了國內(nèi)外研究熱點，木蘭科植物黃酮類化合物含量的測定已有不少研究，但是抗氧化性能方面的研究很少。因此，本試驗采用華木蓮的內(nèi)生真菌作為對象研究其抗氧化性，結(jié)果顯示華木蓮葉內(nèi)生真菌SL-3是可以產(chǎn)生較多抗氧化物質(zhì)的菌株，符合相關(guān)文獻(xiàn)描述的植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與植物本身相似或相同的抗氧化性物質(zhì)[5]，而且提取物中的抗氧化物質(zhì)還是比較多的，對于超氧陰離子自由基、羥基自由基有較強(qiáng)的抑制作用，它們的多種抗氧化活性預(yù)示著其產(chǎn)生相關(guān)抗氧化化合物的能力；有望成為較好的天然抗氧化性物質(zhì)，為進(jìn)一步對其發(fā)酵工藝研究成為抗衰老保健品的輔料或功能因子奠定理論基礎(chǔ)。

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