李文武，趙維維，張素歌，肖向勤，曾文淵，賈 欣#，姚寒春#

1)河南省食品藥品評(píng)價(jià)中心 鄭州 450018 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001

熒光碳量子點(diǎn)催化魯米諾發(fā)光體系測(cè)定2-甲氧基雌二醇*

李文武1)，趙維維2)，張素歌2)，肖向勤2)，曾文淵2)，賈 欣2)#，姚寒春2)#

1)河南省食品藥品評(píng)價(jià)中心 鄭州 450018 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001

#通信作者，賈欣，女，1975年8月生，碩士，講師，研究方向：藥物分析與藥物治療學(xué)，E-mail：jiaxin@zzu.edu.cn；姚寒春，女，1979年1月生，博士，副教授，研究方向：納米熒光探針在藥物分析中的應(yīng)用，E-mail：yhch@zzu.edu.cn

碳量子點(diǎn)；魯米諾；化學(xué)發(fā)光；2-甲氧基雌二醇

目的：基于熒光碳量子點(diǎn)(CQDs)的催化特性，建立CQDs -魯米諾化學(xué)發(fā)光新體系用于2-甲氧基雌二醇(2-ME)的含量測(cè)定。方法：利用微波熱解法合成熒光CQDs，采用透射電鏡及光譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表征。將CQDs應(yīng)用于魯米諾發(fā)光體系中，考察不同濃度試劑對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，在最優(yōu)條件下，對(duì)凍干粉劑及血漿樣品中的2-ME含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：CQDs溶液可以增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀體系的發(fā)光信號(hào)，因2-ME對(duì)這一體系的發(fā)光有抑制作用，且該作用與2-ME的濃度呈正比關(guān)系，因此建立了檢出限為5.4×10-10g/mL，RSD為1.8%(n=11)的2-ME含量測(cè)定的新方法。結(jié)論：該方法靈敏度高、簡(jiǎn)單快速，適用于藥物制劑及生物樣品中2-ME的含量測(cè)定。

碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots，CQDs)是粒徑在10 nm左右的外形類(lèi)似球形的碳納米材料，具有優(yōu)良的光學(xué)性能、良好的生物相容性、低毒性及制備成本低[1]等特殊優(yōu)勢(shì)，在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域被用作金屬量子點(diǎn)的理想替代品。鐵氰化鉀能直接氧化CQDs，產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，一些金屬離子和生物分子對(duì)發(fā)光有抑制作用，據(jù)此建立了測(cè)定Cr(Ⅵ)和腎上腺素的化學(xué)發(fā)光分析法[2]。將CQDs作為催化劑應(yīng)用于魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系，鈍化后的CQDs對(duì)該發(fā)光體系的催化過(guò)程是一個(gè)典型的1O2誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)制[3]。有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)CQDs在無(wú)外加氧化劑下也可以催化魯米諾化學(xué)發(fā)光，認(rèn)為CQDs具有的電子供體、受體的性質(zhì)是其催化特性的來(lái)源，且通過(guò)改變CQDs的表面基團(tuán)可以調(diào)控其催化性能。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradio，2-ME)是內(nèi)源性雌激素17β-雌二醇非極性的代謝產(chǎn)物[5]。研究[6-10]表明：2-ME對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，可以通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子(如缺氧誘導(dǎo)因子)來(lái)調(diào)節(jié)血管生成、抑制微管蛋白聚合而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并證實(shí)它對(duì)惡性肉瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤和前列腺癌等多種腫瘤有治療作用。HPLC[11-13]、GC[14]、放射免疫法[15]及化學(xué)發(fā)光法[16-17]均可用于測(cè)定2-ME。Zhang等[17]基于納米銀對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的催化特性，利用2-ME對(duì)體系的抑制作用進(jìn)行含量測(cè)定。作者利用CQDs對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系的催化特性，基于2-ME對(duì)該體系強(qiáng)烈的抑制作用，建立了一種2-ME含量測(cè)定的新方法，并分析了其發(fā)光機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 850W Glanz 微波爐(珠海格力電器股份有限公司)，Nano-ZS90 激光納米粒度分析儀(英國(guó)馬爾文公司)，IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津科學(xué)儀器公司)，RF-5301型熒光分光光度計(jì)(日本島津科學(xué)儀器公司)。檸檬酸(宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司)，二甘醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，PEI2500(上海攻碧克新材料科技有限公司)，2-ME凍干粉劑(鄭州大學(xué)藥學(xué)院自制，純度≥99%)，魯米諾(北京索萊寶科技有限公司)，鐵氰化鉀(天津盛奧化學(xué)試劑有限公司)，濃硫酸(H2SO4，體積分?jǐn)?shù)95.0%～98.0%)購(gòu)于北京康普匯維科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 按照?qǐng)D1所示連接各流路，啟動(dòng)儀器，首先用超純水將整個(gè)流路沖洗10 min至信號(hào)穩(wěn)定。再通過(guò)各自的流路將鐵氰化鉀溶液、魯米諾溶液、CQDs溶液及空白樣品(超純水)經(jīng)蠕動(dòng)泵帶入分析系統(tǒng)，得到發(fā)光信號(hào)。待信號(hào)穩(wěn)定后，記錄發(fā)光強(qiáng)度I0。用2-ME樣品溶液替換超純水注入流路，得到發(fā)光強(qiáng)度Is。采用光電倍增管(工作電壓為900 V)對(duì)系統(tǒng)的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行收集與檢測(cè)。以相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ΔI(ΔI=I0-Is)與濃度的關(guān)系對(duì)2-ME進(jìn)行定量分析。

a：魯米諾溶液；b：樣品溶液；c：鐵氰化鉀溶液；d：CQDs溶液；P：蠕動(dòng)泵 (P1為主泵；P2為副泵)；V：進(jìn)樣閥；F：流通池；W：廢液；D：檢測(cè)器；PC：計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)。圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析流路圖

1.3 CQDs的制備及表征

1.3.1 CQDs的制備 CQDs采用微波熱解法制備[17]：將0.2 g PEI2500、1.0 g 檸檬酸和3 mL二甘醇置于100 mL燒杯中，混勻，然后將此混合物放入功率為850 W的微波爐中，在200 ℃下加熱3 min，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黑色固-液混合物。將混合物加水并進(jìn)行超聲溶解，離心15 min(4 000 r/min)，將上清液置于超純水中透析48 h(MWCO=3 500的透析膜)，以除去多余的PEI2500和二甘醇，即得淺棕色CQDs水溶液。

1.3.2 CQDs的表征 在紫外燈下(λ=365 mm)觀察CQDs水溶液的發(fā)光情況，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)CQDs水溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。用RF-5310型熒光分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行熒光光譜的表征。在300～480 nm范圍內(nèi)分別用不同的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)CQDs水溶液，考察CQDs發(fā)射波長(zhǎng)的變化。采用高分辨透射電鏡對(duì)其進(jìn)行形態(tài)表征，采用激光納米粒度分析儀考察CQDs的粒徑分布。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 魯米諾的發(fā)光需要在堿性條件下進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)用NaOH調(diào)節(jié)魯米諾溶液的pH，考察了NaOH在0.03～0.40 mol/L范圍內(nèi)對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。此外，該實(shí)驗(yàn)考察了魯米諾濃度在8.0×10-8～3.0×10-6mol/L范圍內(nèi)、鐵氰化鉀濃度在5.0×10-6～3.0×10-4mol/L范圍內(nèi)對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。在該體系中，CQDs對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系具有很強(qiáng)的發(fā)光增敏作用。該實(shí)驗(yàn)考察了CQDs用量對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 分析特性 作者配制了一系列不同濃度的2-ME標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，采用發(fā)光分析儀對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定。以2-ME濃度C為橫坐標(biāo)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。按照IUPAC的計(jì)算規(guī)定(3σ)，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算檢出限。對(duì)1.0×10-7g/mL的2-ME進(jìn)行11次平行測(cè)定，考察其精密度。該實(shí)驗(yàn)還考察了金屬離子、藥用輔料及可能存在的干擾成分對(duì)2-ME標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-7g/mL)測(cè)定的影響。

1.5.2 樣品制備 稱取適量不同批次的2-ME凍干粉末，先使用甲醇通過(guò)超聲溶解，再用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取適量濾液定容于100 mL容量瓶中作為儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。人血漿來(lái)自河南省紅十字血液中心。各取3份100 μL血漿，分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度的2-ME標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入600 μL甲醇以去除蛋白，渦旋3 min使其混合均勻，12 000 r/min離心15 min，收集上清液備用。另取一份不加2-ME的血漿按同樣方法處理作為空白對(duì)照溶液。

1.6 反應(yīng)機(jī)制探討 用紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)(關(guān)閉光源)對(duì)CQDs、2-ME、魯米諾-鐵氰化鉀、魯米諾-鐵氰化鉀-CQDs及魯米諾-鐵氰化鉀-CQDs-2-ME的紫外吸收光譜和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描。通過(guò)峰位置和強(qiáng)度的變化，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，判斷發(fā)光體，推測(cè)可能的反應(yīng)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 CQDs的表征 CQDs水溶液在紫外燈照射下(λ=365 nm)呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，紫外全波長(zhǎng)掃描顯示CQDs在230及290 nm處各有一個(gè)特征吸收峰(圖2)。激發(fā)波長(zhǎng)在300～480 nm范圍內(nèi)，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加，發(fā)射波長(zhǎng)也逐漸增大，CQDs的發(fā)射峰強(qiáng)度在激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm時(shí)最大(λem=400 nm)(圖3)。高分辨透射電鏡表征見(jiàn)圖4，CQDs的外觀呈粒徑在4～7 nm的球形且大小分布均勻；單個(gè)CQDs表面具有間距在0.7 nm左右晶格條紋，CQDs的粒徑主要分布在6 nm左右。

右上圖為CQDs水溶液和紫外燈照射下的熒光圖2 CQDs的紫外掃描圖譜

圖3 不同激發(fā)波長(zhǎng)下CQDs的發(fā)射光譜圖

圖4 CQDs高分辨透射電鏡圖(A,B)及粒徑分布(C)

2.2 實(shí)驗(yàn)條件 如圖5A所示，當(dāng)NaOH濃度增加至0.2 mol/L時(shí)ΔI達(dá)最大，因此實(shí)驗(yàn)選擇的NaOH濃度為0.2 mol/L。根據(jù)圖5B所示，ΔI的變化與魯米諾濃度呈正相關(guān)，綜合考慮信噪比、峰穩(wěn)定性和試劑消耗，選用2.0×10-6mol/L的魯米諾溶液。隨著鐵氰化鉀濃度的增加ΔI逐漸增大，當(dāng)鐵氰化鉀濃度為5.0×10-5mol/L時(shí)，ΔI達(dá)到最大(圖5C)，之后ΔI逐漸降低，所以鐵氰化鉀最佳濃度為5.0×10-5mol/L。如圖5D所示，當(dāng)所用CQDs溶液稀釋6.0×104倍時(shí)，ΔI達(dá)到最大，而后ΔI逐漸降低，因此CQDs的最佳稀釋倍數(shù)為6.0×104倍。

圖5 NaOH、魯米諾、鐵氰化鉀和CQDs稀釋度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.3 方法學(xué)考查結(jié)果 ΔI與C在(2.0×10-9～5.0×10-7) g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為ΔI=39.183C+51.397，r=0.999 1，檢出限為5.4×10-10g/mL。以2-ME標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，11次平行測(cè)定的RSD為1.8%。相對(duì)誤差不大于5%的情況下，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，可以看出一些常見(jiàn)離子和藥物添加劑對(duì)2-ME的測(cè)定基本沒(méi)有影響。

表1 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)凍干粉劑儲(chǔ)備液中和人血漿中2-ME的含量進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2