王俊剛，趙婷婷，楊本鵬，王文治，蔡文偉，馮翠蓮，曾軍，熊國如，張樹珍（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101）

甘蔗脫毒健康種苗中蔗糖合成酶基因差異表達(dá)分析

王俊剛，趙婷婷，楊本鵬，王文治，蔡文偉，馮翠蓮，曾軍，熊國如，張樹珍*
（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101）

甘蔗種苗經(jīng)過脫毒處理能夠提高甘蔗生物量和糖分，而蔗糖合成酶是甘蔗生長和蔗糖積累的關(guān)鍵性酶。本文分析了2種甘蔗蔗糖合成酶基因SUS4和SUS7在脫毒種苗和常規(guī)種苗全生育期的表達(dá)量差異。結(jié)果表明，SUS4和SUS7在整個生育期葉片和未成熟莖稈中差異表達(dá)，苗期是下調(diào)表達(dá)，其它時期是上調(diào)表達(dá)，在拔節(jié)期成熟莖稈SUS4和SUS7上調(diào)表達(dá)，而在成熟期成熟莖桿中SUS4和SUS7下調(diào)表達(dá)，說明蔗糖合成酶基因在脫毒處理過程中，對不同類型蔗糖合成酶基因的時空表達(dá)特性的影響不同，而不同的生育期可能不同的蔗糖合成酶基因所起生理功能不同，形成一種相互調(diào)控的的基因網(wǎng)絡(luò)，最終有利于甘蔗產(chǎn)量的形成和蔗糖的累積。

甘蔗；蔗糖合成酶；基因差異表達(dá)；Real-Time；脫毒種苗

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是熱帶、亞熱帶C4植物，CO2利用率、光合速率、單位面積生物產(chǎn)量和蔗糖含量顯著高于其他作物；甘蔗糖占世界蔗糖總量的80%，乙醇生產(chǎn)總量的40%[1]。蔗糖是甘蔗積累的主要物質(zhì)，而調(diào)控蔗糖代謝的關(guān)鍵酶有3種，蔗糖磷酸合成酶（SPS），蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase;SUS，E.C.2,4.1.1 3）。其中，蔗糖磷酸合成酶催化蔗糖合成，蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖降解，而蔗糖合成酶催化果糖和核苷二磷酸（NDP）（蔗糖+NDP?NDP-葡萄糖+果糖）之間的葡糖基部分的可逆轉(zhuǎn)移。蔗糖轉(zhuǎn)化的平衡是pH依賴性的，5.5～7.5的pH值促進(jìn)NDP-葡萄糖形成，7.5～9.0的pH值能夠促進(jìn)蔗糖合成[2－3]。由于蔗糖合成酶具有分解和合成蔗糖的雙重屬性，所以在調(diào)控蔗糖代謝中起更重要的作用，能影響植物整個生物量的形成和糖分積累[4-6]。

蔗糖合成酶被一個小型的基因家族所編碼，在擬南芥[7]和水稻[8]有6個SUS基因，毛茛中發(fā)現(xiàn)有7個SUS基因[9]。玉米中同源基因Sh1和Sus1編碼兩種生物活性相似的SUS1和SUS2同工酶[10]。在玉米根尖細(xì)胞中，Sh1和Sus1卻能被葡萄糖誘導(dǎo)，它們對糖的響應(yīng)存在顯著差異，低濃度葡萄糖促進(jìn)Sh1基因的表達(dá)，抑制Susl基因表達(dá)；高濃度葡萄糖則抑制Sh1基因表達(dá)，促進(jìn)Sus1基因表達(dá)[11]。此外在大麥和小麥中也對蔗糖合成酶基因表達(dá)進(jìn)行了分析[12-13]。小麥Sus2基因主要在胚乳中表達(dá)，而Sus1基因在根和葉中也有表達(dá)，低溫和厭氧條件能夠誘導(dǎo)Sus2基因的表達(dá)[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小麥Sus1和Sus2基因位于不同的同源染色體上[15-16]。甘蔗中也分別克隆得到6個SUS基因，并進(jìn)行單倍型分析，不同品種單倍型和SNP的頻率不同[17]；雷美華等[18]分段擴(kuò)增并克隆了甘蔗SUS基因，該基因?qū)儆诙嗷蚣易?，在分類上屬于雙子葉SUSA族，所克隆的甘蔗SUS基因全長7545bp，與Lingle等[2]報道的甘蔗SUS序列相似性達(dá)到99%。進(jìn)一步研究分析，SUS基因在不同部位的表達(dá)差異明顯并且酶活性的變化趨勢與蔗糖含量的變化情況相一致，二者呈高度的正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.995）[19]，說明SUS基因在甘蔗蔗糖積累中可能起非常重要的作用。

甘蔗是多年多季無性繁殖與宿根栽培作物，幾乎所有甘蔗品種在大規(guī)模應(yīng)用后均受到多種的危害，導(dǎo)致品種退化，造成甘蔗減產(chǎn)達(dá)10%～50%，然而甘蔗是異源多倍體，遺傳背景復(fù)雜，雜交F1代分離類型繁多，優(yōu)良基因重組率極低，優(yōu)良性狀的聚合就更難。致使傳統(tǒng)的‘五圃制’育種程序長達(dá)10～15年，育種效率很低。于是采用熱處理結(jié)合腋芽分生組織培養(yǎng)技術(shù)培育的脫毒健康種苗能夠有效延長優(yōu)良品種使用年限，恢復(fù)母本優(yōu)良性狀，提高甘蔗產(chǎn)量和蔗糖含量[20-21]，但從分子水平解釋增產(chǎn)和增糖機(jī)理還未見報道。本文利用已報道的兩個蔗糖合成酶基因SUS4和SUS7為研究對象，分別從甘蔗生長的苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期對其表達(dá)量進(jìn)行比較分析，探討脫毒處理對蔗糖合成酶表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為新臺糖22號品種和其經(jīng)過腋芽脫毒健康種苗二代種莖苗，材料來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心。種植于海南省臨高縣皇桐鎮(zhèn)國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)站。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理辦法見參照文獻(xiàn)[21]的有關(guān)方法進(jìn)行。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

每個樣品從10個生長一致植株進(jìn)行混合取樣，甘蔗成熟葉片為+3葉、未成熟葉片為0葉，莖桿由生長點(diǎn)向下計(jì)算甘蔗莖節(jié)數(shù)，每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。取得的樣品在液氮中進(jìn)行研磨，按照Trizol法提取總RNA，并參照TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)公布的甘蔗蔗糖合成酶基因SUS4(GenBank登錄號：KM598653.1)、SUS7(GenBank登錄號：BU925832.1)序列利用primer3設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參GADPH基因引物參考[22]設(shè)計(jì)。

表1 引物序列、PCR擴(kuò)增基因片段和擴(kuò)增效率Table 1 Primer sequences, the am p lified fragments and am p lification efficiency

1.4 RealTime-PCR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析

建立20μL熒光定量PCR反應(yīng)體系，選用SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒，按照說明書操作要求配制，反應(yīng)在Mx3005P上完成，每個處理設(shè)置3次試驗(yàn)重復(fù)，擴(kuò)增效率見表1。以甘蔗GADPH基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有結(jié)果以2-ΔΔCT法計(jì)算相對定量值[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期蔗糖合成酶基因表達(dá)分析

Q-PCR結(jié)果顯示：SUS4和SUS7基因在苗期甘蔗葉片中均有表達(dá)；在未成熟葉片中SUS4比對照低2倍多，SUS7比對照低40%左右；而在成熟葉片中，SUS4和SUS7比對照低2倍左右（結(jié)果見圖1）。

圖1 甘蔗苗期不同組織蔗糖合成酶基因相對表達(dá)量Fig.1 Relative gene expression level of sucrose synthetase genes in different sugarcane tissues at seedling stage

2.2 分蘗期蔗糖合成酶基因表達(dá)分析

選擇甘蔗分蘗中期蔗糖合成酶基因表達(dá)特征進(jìn)行分析。在甘蔗第一棵分蘗苗長出7d后，對主莖甘蔗葉片進(jìn)行采樣。結(jié)果表明：SUS4在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達(dá)量分別比對照高3倍左右；SUS7在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達(dá)量分別比對照高4倍和5倍（結(jié)果見圖2）。

2.3 拔節(jié)期蔗糖合成酶基因表達(dá)分析

SUS4表達(dá)量在拔節(jié)期脫毒健康種苗葉片中比對照無明顯差異，而在莖稈中伴隨成熟度的增加表達(dá)量逐漸降低，在1～5莖節(jié)中表達(dá)量比對照高3倍左右，7～23節(jié)其表達(dá)量與對照無明顯差異；SUS7表達(dá)量在拔節(jié)期脫毒健康種苗葉片中比對照高3倍，而在莖稈伴隨成熟度的增加表達(dá)量逐漸降低，在1～5莖節(jié)中表達(dá)量最高，比對照高2倍左右，在10～23節(jié)中表達(dá)量趨向一致，與對照無明顯差異（見圖3）。

圖2 分蘗期甘蔗不同組織蔗糖合成酶基因相對表達(dá)量Fig.2 Relative gene expression level of sucrose synthetase gene in different sugarcane tissues at tiller grow th stage

圖3 拔節(jié)期甘蔗不同組織蔗糖合成酶基因相對表達(dá)量Fig.3 Relative gene expression levels of sucrose synthetase genes in different sugarcane tissues at elongation grow th stage YL：未成熟葉片；ML：成熟葉片；1：1～3節(jié)；2：4～5節(jié)；3：7～8節(jié)；4：10～11節(jié)；5：13～14節(jié)；6：16～17節(jié)；7：19～20節(jié)；8：22～23節(jié)YL:young leaf;ML:mature leaf;1:1-3 internodes;2:4-5 internodes;3:7-8 internodes;4:10-11 internodes;5:13-14 internodes;6:16-17 internodes;7:19-20 internodes;8:22-23 internodes

2.4 成熟期蔗糖合成酶基因表達(dá)分析

SUS4在成熟期脫毒種苗未成熟葉片中表達(dá)量比對照高出2倍左右，成熟葉片中高出接近3倍；在1～3節(jié)中比對照高3倍左右，伴隨節(jié)間成熟度增加，表達(dá)差異逐漸降低，到7～8節(jié)時差異不明顯，13～14節(jié)后比對照低2倍左右；SUS7在成熟期脫毒種苗葉片中表達(dá)量比對照高5倍左右，在1～3節(jié)中比對照高7倍左右，伴隨節(jié)間成熟度增加，表達(dá)差異逐漸降低，到10～11節(jié)時仍比CK高；13～14后比對照低2倍左右（見圖4）。

圖4 成熟期甘蔗不同組織蔗糖合成酶基因相對表達(dá)量Fig.4 Relative gene expression level of sucrose synthetase gene in different sugarcane tissues atmature grow th stage YL：未成熟葉；ML：成熟葉；1：1～3節(jié)；2：4～5節(jié)；3：7～8節(jié)；4：10～11節(jié)；5：13～14節(jié)；6：16～17節(jié)；7：19～20節(jié)；8：22～23節(jié)；9：29～30節(jié)；10：36～37節(jié)YL:young leaf;ML:mature leaf;1:1-3 internodes;2:4-5 internodes;3:7-8 internodes;4:10-11 internodes;5:13-14 internodes;6:16-17 internodes; 7:19-20 internodes;8:22-23 internodes；9:29-30 internodes;10:36-37 internodes

3 討論

甘蔗脫毒健康種苗能夠有效提純復(fù)壯優(yōu)良的品種，保證其生產(chǎn)潛力，延長品種使用年限。關(guān)于脫毒健康種苗在基因水平與未脫毒的比較還很少報道[24]。蔗糖合成酶是蔗糖代謝調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞碳水化合物的分配和庫器官中蔗糖強(qiáng)度發(fā)揮重要作用[25-26]。對柑橘6種蔗糖合成酶基因的組織表達(dá)特性分析表明，蔗糖合成酶基因在柑橘新老葉片、花和果實(shí)中表達(dá)存在差異，其中Sus1、Sus2、Sus5、Sus6在柑橘果肉中高表達(dá)，Sus3和Sus4在幼葉中表達(dá)量高，但在成熟的葉片中表達(dá)量很低，在果實(shí)形成過程中，果肉中Sus5表達(dá)快速積累，而Sus6含量卻逐漸下降[27]。對桃樹Sus基因家族的研究表明，果實(shí)中PpSus表達(dá)量與桃果的發(fā)育階段存在聯(lián)系[28]。楊樹中過表達(dá)棉花Sus可顯著加快木質(zhì)部纖維素積累和次生壁加厚，改變糖的分配途徑[29]。各種SUS基因表達(dá)量和表達(dá)部位的不同，也決定了其在糖分和碳分配不同階段的作用不同。

甘蔗脫毒健康種苗葉片中SUS4和SUS7在不同生長階段比對照差異表達(dá)明顯，苗期蔗糖合成酶基因表達(dá)明顯低于對照，可能此階段蔗糖合成酶表達(dá)量的降低有利于單糖的積累，促進(jìn)葉片的快速生長；而經(jīng)過苗期后，葉片的生理功能發(fā)生變化，蔗糖合成酶表達(dá)的升高，有利于蔗糖輸出，為其它生長部位提供更多的碳源。SUS4和SUS7在脫毒健康種苗快速生長的1～8莖節(jié)中的表達(dá)明顯高于對照，可能是脫毒莖節(jié)相對生長旺盛，需要更多的碳源進(jìn)行蔗糖的累積，因此進(jìn)一步需要更多的蔗糖合成酶的表達(dá)，合成更多的蔗糖；在拔節(jié)期7～8節(jié)之后的莖節(jié)，SUS4和SUS7表達(dá)沒有變化，可能此兩種基因的表達(dá)對蔗糖合成酶活性的影響不明顯。另外在成熟莖節(jié)中表達(dá)量降低，能夠有效抑制分解方向的活性，促進(jìn)甘蔗糖分積累，提升甘蔗品質(zhì)。通過對整個生長期脫毒健康種苗和非脫毒苗中的蔗糖合成酶差異表達(dá)研究表明：蔗糖合成酶基因與甘蔗蔗糖積累有一定的相關(guān)性，而不同的生長期可能不同的蔗糖合成酶基因所起功能不同，形成一種相互調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)，有利于最終甘蔗產(chǎn)量的形成和蔗糖的累積。

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Differential Expression Analysis of Sucrose Synthase Genes in Disease-free Sugarcane Seed lings

WANG Jun-gang,ZHAO Ting-ting,YANG Ben-peng,WANGWen-zhi,CAIWen-wei,et al
(Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture,Haikou 571101,Hainan)

The biomass and sugar content can be improved in disease-free sugarcane seedling.Sucrose synthase is the key enzyme for sugarcane growth and sucrose accumulation.The expression differences of sucrose synthase genes,SUS4 and SUS7,were analyzed in disease-free sugarcane seedlings at different growth stages.The results showed that the expression levels of SUS4 and SUS7 were down-regulated in sugarcane leaves and immature internodes at seedling stage but up-regulated in sugarcane leaves and immature internodes at tillering,elongation and mature stages.Moreover,the expression levels of SUS4 and SUS7 were up-regulated in sugarcane mature internodes at elongation stage but down-regulated in sugarcane mature internodes at mature stage.It demonstrated that the expression patterns of SUS4 and SUS7 were differently regulated in different sugarcane tissues at different growth stages through disease-free treatment.The expression differences of SUS4 and SUS7 showed that different types of sucrose synthase together functioned to regulate sucrosemetabolism,and further to facilitate sucrose accumulation and biomass formation.

sugarcane;sucrose synthase;gene difference expression;Real-Time;disease-free seedlings

S566.103；Q 78

A

1007－2624（2017）04－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.04.001

2017-03-30

“863”計(jì)劃（2013AA102604-1）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（ITBB2015RC04，ITBB2015ZY12）；海南省自然科學(xué)基金（20163124）。

王俊剛（1982-），博士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)，E-mail：wangjungang@itbb.org.cn

張樹珍（1965-），博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事甘蔗生物學(xué)的研究，E-mail：zhangsz2007@163.com