趙娟瑩，劉佳明，馮志娟，陳明，周永斌，陳雋，徐兆師，郭長虹

（1哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院/黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150025；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室，北京 100081）

大豆鋅指轉(zhuǎn)錄因子GmDi19-5對高溫的響應及互作蛋白的篩選

趙娟瑩1,2，劉佳明2，馮志娟2，陳明2，周永斌2，陳雋2，徐兆師2，郭長虹1

（1哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院/黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150025；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室，北京 100081）

【目的】高溫脅迫已經(jīng)成為威脅作物生長發(fā)育的主要非生物脅迫因素之一，轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫響應中起著重要作用。通過對大豆鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因GmDi19-5在高溫脅迫下的響應和功能鑒定，以及利用酵母雙雜交技術(shù)從大豆cDNA文庫篩選與其互作的候選蛋白，研究GmDi19-5對高溫脅迫的響應機制?！痉椒ā恳源蠖筩DNA為模板，利用實時熒光定量PCR檢測GmDi19-5在高溫處理不同時間段的表達模式；通過PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫預測GmDi19-5啟動子元件，并對GmDi19-5啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥在高溫處理下進行的組織化學染色，分析GmDi19-5啟動子在高溫脅迫下的活性；構(gòu)建pGBKT7-GmDi19-5誘餌載體，驗證自激活活性；利用酵母雙雜交技術(shù)，以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫，篩選與其互作的候選蛋白；進一步用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證GmDi19-5與候選蛋白的互作；利用實時熒光定量PCR檢測候選蛋白基因在對高溫處理的響應情況；構(gòu)建融合表達載體，用GFP-GmDi19-5融合表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，檢測GmDi19-5蛋白的亞細胞定位情況?！窘Y(jié)果】實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，GmDi19-5在高溫脅迫下上調(diào)表達；啟動子元件分析表明，GmDi19-5包含多種與脅迫應答相關(guān)的順式作用元件，包括熱響應元件HSE；組織化學染色分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫處理后，過表達擬南芥幼苗的地上部分和地下部分均有報告基因的表達；亞細胞定位結(jié)果表明，GmDi19-5蛋白定位于擬南芥原生質(zhì)體的細胞核中；通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到了與GmDi19-5互作的候選蛋白，試驗進一步驗證了GmDi19-5與GmDnaJ在酵母細胞中互作；另外，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，互作蛋白基因GmDnaJ受高溫脅迫誘導表達。【結(jié)論】GmDi19-5受高溫誘導表達，GmDi19-5可能與GmDnaJ互作，表明GmDi19-5功能的發(fā)揮可能需要GmDnaJ的參與。

大豆；鋅指轉(zhuǎn)錄因子；高溫；酵母雙雜交；蛋白互作

0 引言

【研究意義】植物的生長發(fā)育受到多種脅迫的影響，隨著溫室效應的加劇，全球氣候逐漸變暖；高溫已經(jīng)成為威脅植物生長發(fā)育的主要因素之一，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。因此，研究高溫響應基因，探討植物高溫信號傳導途徑，對提高植物抗逆性、增加農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要的意義。【前人研究進展】轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）也稱反式作用因子，是真核生物中能與順式作用元件特異結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子最先是在玉米中發(fā)現(xiàn)的[1]，之后相繼得到多種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫相關(guān)基因的表達[2]。鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[3]，是由鋅原子作為核心、半胱氨酸或組氨酸環(huán)繞鋅原子形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)[4]。C2H2類鋅指蛋白包含2個半胱氨酸和2個組氨酸，典型的結(jié)構(gòu)為Cys-X2,4-Cys-X12-His-X3,4,5-His[5]。Di19（drought- induced）蛋白屬于C2H2類鋅指蛋白，包含C2H2類鋅指結(jié)構(gòu)域[6]、“DPLLSF”位點和“FVQDLVL”位點，這些結(jié)構(gòu)域位點在單子葉和雙子葉植物中都是十分保守的。在植物生長發(fā)育以及對非生物脅迫的響應中，Di19蛋白起到關(guān)鍵的作用[7-9]。Di19類蛋白首先是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，并鑒定出了7個同源基因，這些Di19類基因在擬南芥組織中廣泛表達，并且受脅迫誘導；其中Di19-1在干旱脅迫處理后表達量上升，Di19-2和Di19-4受鹽脅迫迅速表達，Di19-3在ABA存在時也能調(diào)控植物對干旱和鹽脅迫的響應[10]。AtDi19-7與光信號的調(diào)控有關(guān)，但它對非生物脅迫無響應[11]。水稻中有5個Di19類基因，被OsCDPK14磷酸化后的OsDi19-4通過調(diào)控ABA相關(guān)基因的表達來正向調(diào)控ABA脅迫[12]。另外，Di19鋅指蛋白還能結(jié)合DNA元件[13]，參與蛋白互作[14]。據(jù)報道，AtDi19-7能夠與AtLKP2相互作用，AtLKP2是一種參與泛素介導的蛋白質(zhì)降解的蛋白質(zhì)[14-15]；擬南芥7個Di19基因中5個己經(jīng)證明能與AtCPK（一種結(jié)合Ca2+的蛋白激酶）相互作用并被后者磷酸化[6]?！颈狙芯壳腥朦c】在之前的研究中，筆者已鑒定出7個大豆Di19基因[16]，不同的大豆Di19基因能夠?qū)Ω鞣N非生物脅迫以及植物激素產(chǎn)生不同的響應，其中GmDi19-5在鹽、干旱、ABA和氧化脅迫的誘導下表達量上升比較明顯，但尚未見GmDi19-5對高溫脅迫響應的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過實時熒光定量PCR鑒定GmDi19-5對高溫脅迫的響應；另外，以pGBKT7- GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫，得到一些可能與其互作的候選蛋白基因，并驗證GmDi19-5與候選蛋白的互作關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

大豆（Glycine max）材料為鐵豐8號，由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所邱麗娟老師贈送。將大豆種子播種于營養(yǎng)土中（蛭石﹕泥炭土=1﹕1），在適宜條件下（12 h光照/12 h黑暗、溫度25℃、濕度70%）生長兩周，然后對其進行高溫和低溫脅迫處理：將大豆幼苗分別置于42℃和4℃培養(yǎng)箱中[17-18]，分別處理0、1、4、8、12和24 h后取樣，迅速置于液氮低溫處理后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 誘餌載體的構(gòu)建及自激活驗證

根據(jù)GmDi19-5的序列以及表達載體pGBKT7的限制性酶切位點（SmaⅠ和PstⅠ）設計引物，利用PCR技術(shù)擴增出包含有酶切位點的完整GmDi19-5讀碼框，同時對pGBKT7載體進行雙酶切，將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中（天根，北京）。

酵母菌株AH109感受態(tài)細胞按照試劑盒說明書制備（Yeastmaker? Yeast TransformationSystem 2 User Manual，Clontech公司）。將1 μg的pGBKT7-GmDi19-5重組質(zhì)粒加入制備好的酵母感受態(tài)細胞中，再加入2.5 mL PEG/LiAc，輕輕混勻，30℃水浴30 min誘導轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞；再加入20 μL DMSO，42℃水浴15 min；高速離心15 s棄上清，將菌體重懸于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)90 min；高速離心棄上清，將菌體重懸于1 mL NaCl中，取一定量菌液涂到SD/-Trp、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上，驗證pGBKT7-GmDi19-5重組質(zhì)粒是否存在自激活。

1.3 共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞及陽性克隆的篩選與分析

構(gòu)建大豆cDNA文庫：利用Trizol試劑盒提取大豆RNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，將達到要求的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)得到第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板進行LD-PCR擴增，合成雙鏈cDNA，并克隆到pGADT7載體上，分析cDNA插入片段，分析得到大豆cDNA文庫[19]。

將10 μg的誘餌載體pGBKT7-GmDi19-5質(zhì)粒及10 μg的大豆cDNA文庫質(zhì)粒加入制備好的酵母感受態(tài)細胞中，再加入2.5 mL PEG/LiAc，輕輕混勻，30℃水浴30 min誘導共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞。將共轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細胞涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/-Trp/ -Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基中，放于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d左右，挑取直徑大的酵母陽性單克隆，涂布于SD/-Trp/ -Leu/-His/-Ade/X-gal顯藍板上培養(yǎng)，篩選藍色陽性單克隆。

篩選到的陽性酵母菌落挑取于1 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，酵母培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)3—4 h后進行PCR檢測。PCR反應條件參考于太飛等[20]方法，略有修改。跑膠后挑選其中大于750 bp的菌提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10（天根，北京）中，送到北京博邁德生物公司測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行同源性比對分析，篩選出含有正確序列的目的基因。

1.4 RNA提取及實時熒光定量PCR分析

用試劑盒（天根，北京）提取大豆材料RNA，具體提取方法參考試劑盒說明書，提取好的RNA按照反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒（天根，北京）合成單鏈cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至200 ng·μL-1作為cDNA模板待用。利用實時熒光定量PCR儀ABI7500檢測目的基因GmDi19-5表達模式。反應體系參考ZHAO等[21]方法。以大豆Actin作為內(nèi)參，每個反應3次重復。按照基因相對表達分析2-ΔΔCT方法分析GmDi19-5的相對表達量及其標準差。

1.5 亞細胞定位

將GmDi19-5全序列與綠色熒光蛋白基因GFP連接，構(gòu)建16318hGFP-GmDi19-5融合表達載體，用生長兩周的擬南芥為材料制備原生質(zhì)體，利用瞬時轉(zhuǎn)染法將對照GFP空載體和重組質(zhì)粒分別導入原生質(zhì)體，室溫培養(yǎng)16 h，通過激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM700）觀察GmDi19-5的定位情況，具體方法參考HE等[22]方法。

1.6 GmDi19-5啟動子分析

選取GmDi19-5起始密碼子ATG上游1 206 bp的序列，在啟動子分析軟件PlantCARE（plant cis-acting regulatory elements, http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/ plantcare/html/）和PLACE（Plant cis-acting regulatory elements, http://www.biomedsearch.com/nih/ PLACE/）中對其啟動子元件進行分析。

將GmDi19-5啟動子構(gòu)建載體，待啟動子區(qū)轉(zhuǎn)基因擬南芥（Columbia-0）T2代長出第3、4片葉時，將其移入42℃培養(yǎng)箱高溫處理1 h，對照為正常條件（22℃）生長的轉(zhuǎn)基因幼苗；將植物材料置于離心管中，加入配置好的GUS染色工作液至完全覆蓋材料，常溫下避光過夜染色；染色結(jié)束后依次用25%、50%、75%、95%的酒精洗脫，之后在顯微鏡下觀察報告基因的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 GmDi19-5啟動子的序列分析

前期研究發(fā)現(xiàn)GmDi19-5對干旱、高鹽、氧化、ABA脅迫均有響應[16]。為了進一步解析GmDi19-5是否應答高溫脅迫，首先分析了GmDi19-5啟動子的順式元件。通過對起始密碼子ATG上游1 206 bp序列的分析顯示，GmDi19-5的啟動子區(qū)含有多個元件，其中包括啟動子基本元件，如TATA-box和CAAT-box等；另外，GmDi19-5啟動子含有一些脅迫相關(guān)元件，如光應答元件Box 4（ATTAAT）3個、Sp1（CC(G/A)CCC）、G-Box（CACGTT）等，分散在啟動子區(qū)內(nèi)；干旱誘導應答元件MBS（CAACTG）1個；茉莉酸甲酯響應順式調(diào)控元件CGTCA-motif（CGTCA）；水楊酸響應元件TCA-element（CCATCTTTTT）及其他一些調(diào)控序列。另外，還發(fā)現(xiàn)有熱響應元件HSE（AAAAAATTTC）（圖1），位于起始密碼子上游803 bp位置，推測GmDi19-5啟動子可能參與植物對高溫脅迫的響應。

圖1 GmDi19-5啟動子順式元件分析Fig. 1 Cis-element analysis of GmDi19-5 promoter

2.2 高溫脅迫影響了大豆Di19-5基因的轉(zhuǎn)錄表達

為了進一步研究GmDi19-5對極端溫度脅迫的響應，通過實時熒光定量PCR鑒定了溫度對GmDi19-5表達的影響（圖2）。結(jié)果顯示，在高溫脅迫下，大豆Di19-5上調(diào)表達，在脅迫處理12 h時表達量最高，為對照的6.39倍；而在低溫脅迫處理時，GmDi19-5的表達無明顯變化，說明GmDi19-5受高溫脅迫的誘導表達。

圖2 GmDi19-5在高溫（42℃）和低溫（4℃）脅迫處理下的表達模式分析Fig. 2 The expression pattern of GmDi19-5 under high temperature (42℃) and low temperature (4℃) treatments

2.3 GmDi19-5在高溫脅迫下的啟動子活性分析

為了檢測GmDi19-5啟動子的活性，將GmDi19-5啟動子構(gòu)建到GUS表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，高溫處理后進行組織化學染色，觀察報告基因的表達情況。未經(jīng)高溫處理時，報告基因的表達量較低，除在子葉的維管組織有表達外，幼苗的其他組織幾乎沒有報告基因的表達；經(jīng)高溫處理后，報告基因的表達量明顯升高，除新葉外，其表達幾乎遍布植株的其他各個組織，無論是地上部分的子葉、葉原基，還是地下部分的根，均有報告基因的表達，尤其在子葉和根的維管組織表達量極為顯著（圖3），說明高溫脅迫影響了GmDi19-5的組織特異性表達。

2.4 亞細胞定位

將GmDi19-5與綠色熒光蛋白基因GFP連接，構(gòu)建GFP-GmDi19-5融合表達載體，利用瞬時轉(zhuǎn)染法將其導入擬南芥原生質(zhì)體細胞，通過共聚焦顯微鏡觀察分析。結(jié)果顯示，空GFP對照的綠色熒光分布在整個細胞中；而GFP-GmDi19-5融合蛋白的綠色熒光主要分布在細胞核中（圖4），表明GmDi19-5蛋白定位在細胞核上。

圖3 GmDi19-5在高溫脅迫下的啟動子活性分析Fig. 3 Analysis of GmDi19-5 promoter activities under high temperature treatments

圖4 GmDi19-5蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization of GmDi19-5 in Arabidopsis protoplasts

2.5 誘餌載體pGBKT7-GmDi19-5的構(gòu)建以及自激活驗證

將GmDi19-5全長和表達載體pGBKT7由SmaⅠ和PstⅠ酶切位點雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后由連接酶連接得到重組質(zhì)粒pGBKT7-GmDi19-5。為了檢測GmDi19-5是否存在自激活活性，將pGBKT7-GmDi19-5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d（圖5），在SD/-Trp平板能長出酵母菌落，而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上都沒有菌落長出，表明重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞中，且GmDi19-5無自激活活性，可以用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選大豆cDNA文庫。

圖5 pGBKT7-GmDi19-5的自激活驗證Fig. 5 Auto-activation identification of pGBKT7-GmDi19-5

2.6 大豆cDNA文庫的篩選以及候選互作蛋白序列分析

將誘餌載體pGBKT7-GmDi19-5質(zhì)粒與大豆cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細胞涂布于營養(yǎng)缺陷型SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體平板培養(yǎng)基中，放于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，挑取直徑大于2 mm的酵母陽性單克隆，點涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-gal顯藍板上培養(yǎng)，篩選藍色陽性單克?。▓D6）。

圖6 GmDi19-5互作蛋白的篩選Fig. 6 Screening of interacting proteins with GmDi19-5

對篩選到的部分藍色單克隆進行PCR檢測，結(jié)果表明，不同克隆插入的片段大小不同，主要在750 bp左右，大部分克隆擴增結(jié)果為1條帶，但還有一些克隆擴增結(jié)果為2條帶，對于單一條帶的克隆送于公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行同源性比對分析，得到一些大豆候選基因序列（表1），其中，大部分能夠參與植物對逆境脅迫的響應，比如超氧化物歧化酶基因；還有一些與能量代謝相關(guān)基因，比如氨基轉(zhuǎn)移酶基因。這些基因可能參與不同的脅迫響應，調(diào)控大豆的生長發(fā)育；還有一些未知功能基因，也可能與大豆的生長發(fā)育有關(guān)，但尚不清楚功能。

表1 候選基因的BLAST分析結(jié)果及其功能推測Table 1 BLAST analysis and predicted functions of candidate genes

2.7 蛋白互作初步驗證

經(jīng)分析，其中一個篩選到的候選基因包含有完整的DnaJ結(jié)構(gòu)域，命名為GmDnaJ（Glyma11g17930）。為了進一步驗證GmDi19-5和GmDnaJ的互作，將GmDnaJ全長連接在pGADT7載體上，與誘餌載體pGBKT7-GmDi19-5共同轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細胞，并將其涂布于SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上。，在二缺板上，共轉(zhuǎn)和對照都能長出狀態(tài)良好的菌落（圖7-A），說明質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)進感受態(tài)細胞；而在四缺板上，只有當pGBKT7-GmDi19-5和pGADT7-GmDnaJ共同轉(zhuǎn)化時，才有酵母菌株生長，且在不同濃度梯度下都能生長（圖7-B），說明GmDi19-5和GmDnaJ在酵母水平上是互作的。

2.8 候選蛋白的表達模式分析

為了進一步研究GmDi19-5候選蛋白編碼基因?qū)Ω邷孛{迫的響應，通過實時熒光定量PCR對其候選蛋白基因GmDnaJ進行表達模式分析（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，大豆GmDnaJ上調(diào)表達，當脅迫處理8 h時，其表達量達到最高，之后慢慢下降，說明GmDnaJ受高溫脅迫誘導表達，表明GmDi19-5可能通過與GmDnaJ的互作參與高溫響應。

圖7 不同濃度梯度下GmDi19-5與候選蛋白GmDnaJ在酵母細胞中的互作鑒定Fig. 7 Interaction identification of GmDi19-5 with candidate proteins GmDnaJ in yeast cells in dilution series

圖8 GmDnaJ在高溫（42℃）脅迫處理下的表達模式分析Fig. 8 The expression pattern of GmDnaJ under high temperature (42℃) treatments

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠結(jié)合在其他基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，能調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活或抑制下游基因的表達，影響其功能發(fā)揮[23]。轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育以及對非生物脅迫的響應中發(fā)揮著重要的作用[24]，目前已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子，包括DREB、AP2/ERF、WRKY、bZIP、鋅指蛋白等。其中，鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在植物形態(tài)發(fā)生、轉(zhuǎn)錄激活和逆境脅迫等多種生物學進程中起重要作用。Di19蛋白包含C2H2結(jié)構(gòu)域，屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。Di19蛋白在植物體內(nèi)分布廣泛，受脅迫誘導，在維持植物正常的生長發(fā)育中起著重要作用。在之前的研究中，已從大豆基因組中鑒定出了7個Di19，其中，GmDi19-5可能與多種脅迫響應有關(guān)[16]，但對高溫的響應尚無報道。

本研究發(fā)現(xiàn)GmDi19-5的啟動子區(qū)域含有熱響應元件HSE（圖1），推測GmDi19-5對高溫脅迫有響應。實時熒光定量PCR（圖2）和GUS組織特異性表達分析（圖3）表明，GmDi19-5受高溫脅迫誘導表達。為了進一步研究GmDi19-5的作用機制，本研究通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到一些與GmDi19-5互作的候選蛋白基因，其中大部分能夠參與植物對逆境脅迫響應，比如超氧化物歧化酶。據(jù)報道，高溫打破了細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除之間的平衡，加劇了膜脂過氧化作用，造成丙二醛和陰離子自由基等氧化物大量積累，引起膜蛋白與膜內(nèi)脂的變化，從而引發(fā)細胞膜的通透性增大[25]。為了降低高溫造成的傷害，植物體內(nèi)的保護酶（超氧化物歧化酶SOD、過氧化酶POD和過氧化氫酶CAT等）活性改變，減輕膜脂過氧化帶來的傷害[26-27]。然而SOD對植物的保護作用是有限的，隨著溫度的升高，酶活性下降，這種保護作用逐漸減小[28]。另外，據(jù)報道，水稻在高溫脅迫處理時，葉片中的SOD活性持續(xù)下降[29]。因此，當溫度升高時，SOD酶活性降低，對植株的保護作用也隨之降低，生長發(fā)育受到抑制。

候選蛋白之一的DnaJ類蛋白最初是通過對熱激反應的研究得到的，具有熱激蛋白特性，高溫誘導能使其表達量升高[30]。大量研究發(fā)現(xiàn)，DnaJ能與熱激蛋白HSP70結(jié)合，形成分子復合體，在細胞中起分子伴侶的作用，參與植物對熱激脅迫的響應[31-32]。也有研究表明DnaJ蛋白在應對鹽脅迫[33]、重金屬脅迫等方面發(fā)揮作用。本研究驗證了GmDi19-5與GmDnaJ的互作（圖7），推測GmDi19-5可能在轉(zhuǎn)錄后水平上與GmDnaJ的互作，精細調(diào)控植物在環(huán)境脅迫下的生長發(fā)育。

4 結(jié)論

GmDi19-5受高溫脅迫誘導表達，GmDi19-5過表達增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥根系對高溫脅迫的敏感性。

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（責任編輯 李莉）

The Response to Heat and Screening of the Interacting Proteins of Zinc Finger Protein GmDi19-5 in Soybean

ZHAO JuanYing1,2, LIU JiaMing2, FENG ZhiJuan2, CHEN Ming2, ZHOU YongBin2, CHEN Jun2, XU ZhaoShi2, GUO ChangHong1
(1College of Life Science and Technology, Harbin Normal University/Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province, Harbin 150025;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【Objective】Heat stress has become one of main abiotic stresses that threaten plant growth and development. Transcription factors play important roles in plant abiotic stress responses. Drought-induced protein Di19 play an important role in stress signal transduction process in plant. To further explore the functional mechanism of GmDi19-5, the function was identified in high temperature stress and its interacting proteins were screened by yeast two-hybrid system. 【Method】The real-time PCR wasused to analyze the expression patterns of GmDi19-5 under high temperature stress treatment in different time periods. The 1,206 bp sequence upstream of GmDi19-5 was analyzed in PlantCARE and PLACE database. The promoter activity of GmDi19-5 was also analyzed using GUS staining in transgenic Arabidopsis. GmDi19-5 was overexpressed in Arabidopsis to statistically analyze its seed germination and root length under high temperature stress conditions. Bait plasmid pGBKT7-GmDi19-5 was constructed and the self-activation was detected. To obtain the candidate proteins of GmDi19-5, the mixture of recombinant plasmid pGBKT7-GmDi19-5, pGADT7 with soybean cDNA library was introduced into yeast cell AH109. The yeast two-hybrid system was used to screen interactive candidate proteins. Furthermore, the interaction between GmDi19-5 and candidate proteins was analyzed using the yeast two-hybrid system. The response of candidate genes to heat stress was examined by Real-time PCR; GmDi19-5was fused with GFP to detect its subcellular localization in protoplast cells of Arabidopsis. 【Result】The expression pattern analysis showed that GmDi19-5 was involved in responses to abiotic stresses and it was induced by high temperature stress in soybean. After high temperature stress treatment, GUS activities driven by promoter significantly increased in roots, leaf primordium and young leaves in transgenic Arabidopsis. PlantCARE and PLACE database analysis showed that the GmDi19-5 promoter contained a series of cis-element, including heat shock response element (HSE). The subcellular localization analysis revealed that green fluorescence of GFP-GmDi19-5 was mainly in the nucleus. The seed germination and root length assays revealed that GmDi19-5 transgenic Arabidopsis increased sensitivity to high temperature stress. Yeast two-hybrid results showed that candidate protein GmDnaJ interacted with GmDi19-5. Real-time PCR showed that the interactive candidate gene GmDnaJ was induced by heat stress.【Conclusion】The expression of GmDi19-5 was induced by high temperature stress and its overexpression inhibited the growth and development of transgenic plants. Yeast two-hybrid analysis showed that GmDnaJ maybe interact with GmDi19-5 in yeast cells. This result suggests that GmDi19-5 maybe function in abiotic stress responses by interacting with GmDnaJ.

Glycine max; zinc finger protein; high temperature; yeast two-hybrid; protein interaction

2016-12-20；接受日期：2017-02-27

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08009-016B，2016ZX08002-002和2016ZX08004-002）

聯(lián)系方式：趙娟瑩，E-mail：zjy0502@yeah.net。通信作者徐兆師，E-mail：xuzhaoshi@caas.cn。通信作者郭長虹，E-mail：kaku3008@126.com